肠道菌群失调促进慢性便秘发生的机制研究

发布时间：2020-08-15 06:52

【摘要】：目的肠道微生物数目大,类别繁多,相关文献报道人体消化系统内大约定植10万亿微生物,约由400-500种细菌组成,大多数定植于小肠及大肠的不同节段。正常条件下肠道菌群在机体内处于动态稳定平衡状态,不同种类细菌之间互相作用,起到促进宿主胃肠发育及动力、调节免疫及能量代谢,同时还可抵抗致病菌定植等作用。研究发现肠道微生态失衡会导致宿主胃肠动力发生异常,但其具体作用机制及途径并未阐明。临床研究发现便秘病人的肠道菌群在菌落等各个类别中,与健康人存在显著差异,如便秘人群中肠黏膜菌群拟杆菌属丰富度增加,乳酸杆菌及双歧杆菌含量减少。同时大量研究证实5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)为由嗜铬细胞合成并分泌于肠道的重要神经递质;5-羟色胺转运体(serotonin transporter,SERT)则是广泛分布于肠上皮细胞的一种跨膜蛋白,两者相互作用调整肠道运动及内脏敏感性,而肠道环境稳态的破坏可影响SERT表达及肠道动力。本研究拟建立肠道菌群消耗模型后分别予小鼠移植不同人群的肠道菌群,进而评价宿主的胃肠动力改变、肠道组织中中SERT表达差异、肠道动力相关蛋白及宿主肠道菌群改变,主要为进一步阐述肠道菌群失调促进慢性便秘发生发展过程的可能机制研究。方法参照既往文献标准采集粪便样本。动物实验:购入20只6周龄SPF级C57BL/6小鼠随机分为FMT-H组(FMT-H:the group that received the fecal microbiota of healthy;予健康人群粪菌液灌胃干预)和FMT-C组(FMT-C:the group that received the fecal microbiota of constipation patients;予便秘人群粪菌液灌胃干预),先连续3天予抗生素鸡尾酒法(包括500 mg氨苄西林、250 mg万古霉素、500 mg新霉素及250 mg甲硝唑)灌胃处理,建立肠道菌群消耗模型,两组每只模型小鼠每次250 ul(浓度为1:10 g/ml)粪菌液灌胃干预,4-6天连续灌胃,后每间隔一天处理1次,继续处理4次,总实验共为15天。分别检测不同时间段内小鼠排便参数;实验结束后杀死小鼠,取出并冲洗结肠组织,于10%福尔马林及-80℃保存。细胞实验:在37℃及5%二氧化碳条件下,培养基(DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle Medium、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸及微量抗真菌药)培养人结肠癌上皮细胞(Caco-2细胞),生长至70-80%,予饥饿处理12-14小时,分别予不同粪菌液刺激3小时(粪菌液:培养基=1:2000),裂解细胞后储存于-80℃。采用Realtime-PCR和Western blot方法评估不同样本组织中SERT mRNA、MUC 2 mRNA及SERT蛋白表达情况;采用酶联免疫吸附法测定小鼠结肠组织中5-HT相对含量;采用免疫荧光染色方法评价结肠组织中5-HT阳性细胞量、嗜铬细胞阳性数量及肌动蛋白结合蛋白(transgelin)表达水平;模型建立后的小鼠肠道菌群多样性、丰富度及菌群各个级别采用16S rRNA焦磷酸测序方法数量化;运用免疫组织化学染色方法及过碘酸雪夫氏(Periodic Acid-Schiff,PAS)方法评价小鼠结肠MUC2细胞及潘氏细胞数量,探究肠道菌群失调在慢性便秘发生及发展中可能机制。结果1、未予任何处理的野生型小鼠排便参数:2小时排便频率12.6±2.51粒;粪便湿重301.8±33.8 mg;粪便干重119.3±37.2 mg;粪便含水率60.5±10.1%。实验第7天小鼠排便参数显示,FMT-C组小鼠2h排便频率(13.65±3.11 vs 15.39±2.58粒,P0.05)、粪便重量(225.2±46.45 mg vs 269.86±32.66 mg,P0.05)、粪便干重(114.72±29.94 mg vs 134.89±25.15 mg,P0.05)、粪便含水率(48.76%±6.12%vs 50.46%±5.38%,,P0.05)无统计学差异,且与未经干预的小鼠的排便参数相比无明显改变(P0.05)。实验第15天排便参数结果示,FMT-C组小鼠2h排便频率显著减慢(8.48±1.78 vs 12.12±2.89粒,P0.05),粪便重量减轻(151.88±32.32 mg vs 246.68±63.89 mg,P0.01),粪便干重降低(65.49±11.74 mg vs 92.91±23.04 mg,P0.05),粪便含水率减少(56.61%±3.01%vs 61.92%±3.68%,P0.05),与未经干预的小鼠相比,FMT-C组小鼠粪便重量、干重及含水率显著降低,排便频率减慢(P0.05),而FMT-H组小鼠的排便参数有下降趋势,但无统计学意义(P0.05)。2、实验第15天,FMT-C组小鼠胃肠排空时间较FMT-H组明显延长(83.24±11.31min vs 69±2.72 min,P0.05);此外,本研究通过免疫荧光方法发现,transgelin蛋白含量在FMT-C组小鼠结肠组织中相对表达下降。3、SERT mRNA相对表达水平在两组结肠组织中比较结果发现,FMT-C组显著增高(P0.05);其SERT蛋白含量与mRNA增高结果一致(P0.05)。同时,体外实验证实,便秘患者粪菌液可上调Caco-2细胞中SERT的表达含量。4、ELISA方法分析显示,FMT-C组小鼠结肠组织中5-HT水平较FMT-H组显著下降(151.59±10.15 vs 198.68±25.94 ng/ml,P0.01);此外,5-HT水平与胃肠排空时间呈负相关;荧光染色结果显示,FMT-C组肠道组织中5-HT的阳性表达数量较FMT-H组明显减少(P0.05),FMT-C组嗜铬细胞阳性细胞数量表达有减少的趋势,但减少程度无统计学意义(P0.05)。5、通过16S rRNA菌群测序方法发现两组模型小鼠的肠道菌群存在显著差异。在门水平上,FMT-C组粪便中厚壁菌门所占比例降低,拟杆菌门升高;在菌属水平上,梭菌属、乳酸菌属、脱硫弧菌属、产甲烷菌属水平降低,而拟杆菌属和Akkermansia菌属明显增多。6、通过PCR及免疫组化方法评价小鼠肠道化学屏障功能:FMT-C组小鼠结肠中粘蛋白MUC-2 mRNA水平、杯状细胞及MUC-2细胞阳性表达均下降。结论肠道菌群失调通过增加小鼠肠道组织中SERT表达、促进5-HT再摄取及终止其功能和抑制肠道平滑肌收缩等作用促进慢性便秘的发生及发展。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62
【图文】：

流程图,流程图,肠道,灌胃

医科大学硕士学位论文一、对象2 动物分组、干预及组织标本留取方法动物随机分为每组 10 只，共 2 组，予抗生素鸡尾酒连续灌胃 3 天，构群消耗模型[22]。FMT-C 组予便秘人群粪菌液灌胃干预，FMT-H 组予健群粪菌液灌胃干预。粪菌液选择剂量及灌菌频率根据文献制定[23-25]。实 15 天，分别于不同时间段（第 7 天和第 15 天）检测胃肠排空时间、率、2h 粪便重量、2h 粪便干重及粪便含水率，最后处死小鼠，逐层解肠道，留取结肠组织，用冰 PBS 缓冲液冲洗肠道壁内侧后纵形剖开，一半结肠组织液氮暂时保存，剩余结肠沿肠道横轴卷起，用针固定并福尔马林液中并标记。（流程图见图 1）

位论,共聚焦,荧光染色

位论文小鼠排便参数的影响（A 空白对照组、FMT-H组、FMT-H 组及 FMT-C 组粪便重量的变化；重的变化；D 空白对照组、FMT-H 组及 FMT-C调促使小鼠肠道动力异常的胃肠排空时间较 FMT-H 组明显延长（8.05）；同时，共聚焦荧光染色显示 FMT-C达量低于 FMT-H 组。见图 4 及图 5；

肠道菌群失调,共聚焦,荧光染色,小鼠

肠道菌群失调促使小鼠肠道动力异常MT-C 组小鼠的胃肠排空时间较 FMT-H 组明显延长（83.24±11.31mi72 min，P< 0.05）；同时，共聚焦荧光染色显示 FMT-C 组小鼠结肠sgelin 蛋白表达量低于 FMT-H 组。见图 4 及图 5；组胃肠传输时间（FMT-H 组：予健康成人粪菌液；FMT-C 组：予便秘成人粪

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