脂氧素对急性肝衰竭的保护作用及其作用机制探讨

发布时间：2020-08-15 17:04

【摘要】：目的：观察脂氧素A4(LXA4)对体外大鼠肝细胞损伤的保护作用,观察LXA4对急性肝衰竭大鼠的保护作用,并初步探求及作用机制。方法： 1.原位灌流法分离大鼠Kupffer细胞(KCs),采用台盼蓝拒染法测KCs活性,吞噬实验检测KCs功能。采用ED1免疫细胞荧光细胞化学法鉴别KCs纯度。 2.脂多糖(LPS)刺激KCs 12小时、24小时、36小时,分别检测上清中TNF-α的含量,将LXA4与KCs共孵育半小时,后给予LPS,检测细胞上清中TNF-α的含量。 3.将肝细胞与KCs共培养,给予D-氨基半乳糖(D-GaIN)/LPS刺激24小时后检测上清中谷丙转氨酶(ALT)谷草转氨酶(AST)含量,收集肝细胞,Annexin V-FITC法检测细胞凋亡。在给予D-GalN/LPS刺激前半小时先加入LXA4预孵育,再加入D-GalN/LPS刺激,检测细胞上清ALT及AST水平,检测肝细胞凋亡。 4.采用D-GalN+LPS腹腔注射建立大鼠急性肝衰竭动物模型。实验分为六组：正常组、模型组、LXA4小、中、大剂量组、四氢化吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)组。肝组织病理切片观察肝组织损伤情况;自动生化仪检测肝功能；ELISA法检测血清TNF-α及IL-6水平, Caspase 3活性检测试剂盒检测肝组织Caspase3酶活性；Realtime-PCR检测TNF-a mRNA及IL-6 mRNA表达;原位末端标记法(TUNEL)法检测肝细胞凋亡率；分离大鼠肝细胞及Kupffer细胞,提取核蛋白,凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测肝细胞及kupffer细胞核蛋白NF-κB活性。结果： 1.KCs活性测定：活细胞数量在90-96%之间,平均(92.3±2.12)%。每只大鼠分离的KCs总量平均为(2.41±0.32)×107 2.KCs吞噬实验显示有功能的细胞数(95.2±2.58)%。 3.免疫荧光细胞化学检测细胞纯度在(96.3±1.46)% 4.LPS刺激Kupffer细胞后,上清中TNF-α含量在12小时明显升高,24小时达到峰值。用LXA4预孵育组TNF-α含量明显减少(P0.05)。 5.肝细胞与KCs共培养后给予D-GalN/LPS刺激24小时,检测上清液转氨酶水平明显升高,肝细胞凋亡率增加,与LXA4预孵育组比较,P0.05。 6.大鼠急性肝衰竭时,肝组织炎症坏死明显,肝脏转氨酶明显升高,血清IL-6及TNF-a水平显著升高,肝组织TNF-a mRNA及IL-6 mRNA表达明显升高,Caspase3活性明显增强；肝组织TUNEL检测细胞凋亡明显增加,kupffer细胞及肝细胞核蛋白NF-κB活性明显增强；脂氧素组及PDTC组组织学改变均明显好转,肝脏转氨酶、细胞因子及NF-κB活性明显下降(与模型组比较,P0.05,),且脂氧素与疗效存在剂量依存关系；脂氧素大剂量组组及PDTC组比较,上述大部分指标之间P0.05。结论： 1.成功分离了大鼠KCs,在数量活性纯度方面均达到实验要求。 2.在体外实验中,LXA4能够抑制KCs细胞分泌TNF-α,能够减少肝细胞凋亡和坏死。 3.体内实验证实LXA4对急性肝衰竭大鼠具有保护作用。能够提高存活率,明显改善肝脏组织学和生化学指标,减少致炎性细胞因子的表达量,抑制肝细胞凋亡,其护肝作用具有量效关系。 4.LXA4对大鼠急性肝衰竭的保护作用部分是通过阻断kupffer细胞NF-κB活化,减少致炎性细胞因子的分泌来实现的。同时,LXA4能够阻断肝细胞的凋亡途径。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.3

【参考文献】