间充质干细胞及姜黄素对PBC中免疫失调和上皮—间质转化的作用及机理研究

发布时间：2020-08-26 04:04

【摘要】：背景:原发性胆汁性胆管炎(primarybiliarycholangitis,PBC)是以渐进性胆汁淤积,肝内中、小胆管非化脓性破坏性炎症为主要病理表现的自身免疫性肝病。“上游”异常免疫反应和“下游”纤维化损伤是PBC病情进展的两大核心环节。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有低免疫原性及独特的免疫调节作用,有研究显示MSCs移植可以缓解难治性PBC患者病情,但具体机制尚未完全阐明。半乳糖凝集素-9(galectin-9,Gal-9)属于半乳糖凝集素家族(galectin,Gal),可有效调控免疫应答,而Gal-9与PBC疾病活动度以及与MSCs具有怎样的关联性?仍有待进一步探讨。胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs)是PBC发病主要攻击的靶细胞,上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是介导PBC病程后期纤维化发展的重要“桥梁”,姜黄素则具有良好的抗纤维化作用。那么,姜黄素是否可以有效抑制PBC中BECs发生的EMT过程,目前尚不明确。目的:探讨PBC患者体内免疫失调与调控性分子Gal-9的相关性,以及脐带间充质干细胞(umbilical cord-mesenchymal stem cells,UC-MSCs)移植后的短期免疫调节效应;进一步通过UC-MSCs移植治疗PBC模型鼠,探索UC-MSCs的疗效及免疫调节机制;此外,本研究还初步探讨了姜黄素对BECs被诱导发生EMT的效应与作用机制。方法:1)采用流式细胞术检测PBC患者外周血辅助性T细胞1(Thelp1,Thl),辅助性T细胞17(Thelp17,Th17)及调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)的变化。免疫组化法检测干扰素-γ(interferon-γ,IFN-y),白细胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)及叉头状转录因子p3(forkheadtranscriptionfactorp3,Foxp3)在PBC患者肝脏组织中的表达。酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测 PBC 患者血清中 Gal-9的表达水平,并与临床生化指标及免疫细胞亚群进行相关性分析。检测PBC患者UC-MSCs移植24小时后Thl、Th17及Treg细胞亚群与血清中Gal-9的变化,并进行移植前后的比较分析。2)UC-MSCs输注治疗2-辛炔酸耦联小牛血清蛋白(2-octynoicacidcoupled to bovine serum albumin,20A-BSA)诱导的PBC模型鼠,治疗完成后统一处理。肝脏HE染色,并进行病理学评分。ELISA检测丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(E2 components of the pyruvate dehydrogenase complex,PDC-E2)抗体和肝功能指标。Luminex检测血清中炎性因子的表达。流式细胞术检测肝脏、脾脏及外周血中CD4+T细胞亚群变化。逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测肝脏组织中炎性因子的表达。体外利用RT-PCR、免疫印迹法(westernblot)及ELISA检测IFN-y刺激UC-MSCs后Gal-9的表达水平及激活的信号通路蛋白。免疫磁珠分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)分选C57BL/6鼠(B6鼠)脾脏CD4+T细胞,与UC-MSCs及Gal-9阻滞剂α-乳糖(α-lactose)共培养,流式细胞术检测CD4+T细胞凋亡率和增殖率。MACS法分选B6鼠脾脏CD4+CD62L+(naive)初始T细胞,体外向Thl及Th17细胞诱导分化,并与UC-MSCs及α-lactose共培养,流式细胞术检测Th1及Th17细胞百分率。将UC-MSCs与IFN-γ刺激后的BECs共培养,并对Gal-9进行阻滞,RT-PCR检测炎性趋化因子的变化。3)观察姜黄素对TGF-β1诱导下BECs的形态学变化。免疫荧光法、western blot及RT-PCR检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达。RT-PCR检测EMT的关键转录因子Snail2、Twist1及ZEB1的表达。利用western blot进一步检测Smad通路及Hedgehog通路蛋白的表达。结果:1)与正常对照组相比,PBC患者外周血Th1细胞,Th17细胞百分率及绝对数显著升高,而Treg细胞百分率及绝对数显著降低。PBC患者肝脏组织中IFN-γ、IL-17A的表达显著增多。PBC患者血清中Gal-9的表达水平显著降低,且与谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷氨酰转肽酶(glutamyl transpeptidase,GGT)存在负相关性,与其外周血Th1、Th17细胞百分率呈负相关。UC-MSCs移植24小时后,PBC患者外周血Th1、Th17细胞百分率显著下降,而Treg细胞百分率未见明显变化。2)经UC-MSCs移植治疗后,PBC模型鼠肝脏损伤症状得到缓解,血清中PDC-E2抗体的表达水平显著降低。UC-MSCs移植治疗显著下调PBC模型鼠体内不同组织来源的Th1与Th17细胞数量,有效降低肝脏与血清中炎性因子的表达水平。UC-MSCs在IFN-y诱导下能够分泌较高水平的Gal-9,并且UC-MSCs抑制CD4+T细胞增殖、阻碍naive T细胞向Th1、Th17细胞分化的作用与Gal-9密切相关。信号传导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)信号通路与 c-Jun 氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)信号通路参与调控UC-MSCs中Gal-9的产生。此外,UC-MSCs可以通过Gal-9降低IFN-γ刺激下BECs中促炎性趋化因子的表达。3)姜黄素干预48小时后即可改善BECs被诱导的EMT形态。免疫荧光法、western blot及RT-PCR检测结果显示,被诱导的BECs经姜黄素处理后,上皮细胞标志物E-cadherin表达上升,间质细胞标志物Vimentin、α-SMA、N-cadherin表达下降,EMT的关键性转录因子Snail2、Twist1、ZEB1的表达受到显著抑制。姜黄素能够通过上调负性调节蛋白Smad7及SUFU的表达水平,下调激活蛋白的表达水平,抑制Smad及Hedgehog信号通路的活化。结论:PBC患者体内存在局部与系统的免疫紊乱以及Gal-9表达异常;UC-MSCs通过分泌调控性分子Gal-9,从局部和系统两方面进行免疫调节,纠正PBC中的免疫失调,从而控制住PBC发病“上游”的异常免疫反应;姜黄素则通过干扰BECs的EMT过程,有效抑制PBC发病“下游”的纤维化损伤。本研究同时提示针对PBC病情进展的不同阶段,联合多通路进行综合治疗,对于PBC患者大有裨益。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575
【图文】：

细胞,患者,外周血,绝对数

２邋ＰＢＣ患者肝脏组织中ＩＦＮ－ｙ和ＩＬ－１７Ａ表达增多逡逑经免疫组化法检测发现，相较于正常对照组，ＰＢＣ患者肝脏组织可见大量ＩＦＮ－Ｙ阳性逡逑细胞（图２－２Ａ）；邋ＩＬ－１７Ａ主要表达于ＰＢＣ患者肝脏小胆管周围，肝细胞胞浆及核内均未见逡逑明显浸润，正常对照组肝脏中几乎未见ＩＬ－１７Ａ阳表达（图２－２Ｂ）；而Ｆｏｘｐ３主要表达于逡逑细胞核内，与正常对照者相比，未达到统计学差异（图２－２Ｃ）。逡逑３０逡逑

患者,表达水平,血清,负相关

１１（：组：１１＝５，＊＊＊：尸＜０．００１，＼２００）逡逑３邋ＰＢＣ患者血清中Ｃａ丨－９的表达水平显著降低，且与肝脏损伤指标呈负相关逡逑利用ＥＬＩＳＡ检测ＰＢＣ患者及正常对照组血清中Ｇａｌ－９的表达水平，如图２－３Ａ所示，逡逑ＰＢＣ患者血清中的Ｇａｌ－９表达水平显著低于正常对照组。此外，收集整理了这１５例ＰＢＣ逡逑患者的临床生化检测资料，进一步分析Ｇａｌ－９与肝功能损伤指标之间的相关性，结果显示逡逑Ｇａｌ－９表达水平与血清中ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ＧＧＴ的浓度均存在负相关忡（阁２－３Ｂ），但与逡逑血清中ＬＤＨ，邋ＣＨＥ的浓度来见明显相关性（图２－３Ｂ）。逡逑Ａ逡逑１５００］逦｜逦＊＊逦｜逡逑／＾Ｎ逡逑Ｉ邋１０００－邋ｒ＾－ｉ逡逑Ｏ）逡逑ｃｊ＞逦ｐ＾ＨＨｈ逡逑■逡逑Ｏ－ＬＪ逦．————逡逑ＨＣ逦ＰＢＣ逡逑３１逡逑

负相关性,患者,百分率,细胞

４逦ＰＢＣ患者血清Ｇａｌ－９表达水平与外周血Ｔｈｌ和Ｔｈｌ７细胞百分率存在负相关性逡逑将ＰＢＣ患者血清Ｇａｌ－９水平与其外周血Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ细胞百分率进行相关性分逡逑析，发现Ｇａｌ－９与Ｔｈｌ细胞百分率呈负相关（图２－４Ａ），与Ｔｈｌ７细胞百分率存在负相关性逡逑（图２－４Ｂ）；而与Ｔｒｅｇ细胞百分率无显著相关性（图２－４Ｃ）。逡逑ＡＢＣ逡逑ｒ＝－０．８５１逦ｒ＝－０．８７６逦々逦ｒ＝０．４Ｑ３逡逑”逦Ｐ＜邋０．００１逦３－ｉ逦Ｐ＜邋０．００１逦＋邋ｅ－，逦ｎｓ逡逑＃邋Ｖ邋？逦？逦＾邋１逦？？邋？逡逑：：Ｋ邋ｒ：邋＼邋．邋ｉ：逡逑0逦0逦入、，逦＋逡逑0－ｌ逦１逦１逦．逦１逦ｏ－ｌ逦，逦，逦，逦，逦Ｑ邋0－逦１逦．逦，逦

【参考文献】