非酒精性脂肪性肝病机制及标志物的蛋白质组学研究

发布时间：2020-08-28 16:43

　　非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已经成为一种常见的慢性肝病,其发病率逐年上升。它包括单纯性脂肪肝(simple steatosis,SS)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纤维化和肝硬化。脂肪肝是一种良性疾病,而NASH却可进一步发展、恶化成为终末期肝病,严重者可导致死亡。目前NAFLD的发生发展机制至今仍尚不清楚,认为与氧化应激的增加、线粒体损伤和脂肪因子等因素相关,但对导致进行性肝细胞损伤的机制有待于进一步探讨。蛋白质组学是一门研究机体特定条件下功能状态的前沿技术,更贴近机体已经或正在发生的行为和功能状态,可为疾病诊断和治疗提供大量的理论和实验依据。同时,肝活检是一种损伤性的检测方法,而且取得的肝组织样本也不足于大规模的筛选差异蛋白质。因此,本研究以蛋氨酸和胆碱缺乏(methionine and cholinedeficient,MCD)饮食诱导的NAFLD小鼠模型为研究对象,采用差异凝胶电泳(dimensional difference gel electrophoresis,DIGE)技术筛选出与NAFLD密切相关的肝脏差异蛋白质谱,结合生物信息学手段系统的分析了差异蛋白的功能和调控网络,并筛选出重要的节点分子进行了验证,从而为深入探讨NAFLD发生发展的分子机制奠定了基础。同时本研究还采用血清蛋白质组学分析(serological proteomeanalysis,SERPA)技术筛选出与NAFLD密切相关的自身抗原谱,为挖掘NAFLD潜在的血清标志物而提供了理论依据。我们分别用正常饮食与MCD饮食饲养小鼠,并在MCD饲养后的2、5、8周,成功复制出不同病变程度的NAFLD动物模型(单纯性脂肪肝(SS),脂肪性肝炎(NASH)及NASH伴早期肝纤维化。我们采用DIGE技术分析了不同造模时间的正常组和模型组小鼠肝脏蛋白质表达谱的差异,并用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行差异蛋白质的检测,共鉴定了189个差异蛋白。其中SS阶段的差异蛋白58个,NASH阶段的差异蛋白82个,NASH伴早期肝纤维化阶段的差异蛋白162个。这些差异蛋白多数存在于线粒体(52.2%),其次为细胞外区域(13.4%)、内质网(10.4%)、细胞浆(9.0%)、细胞核(9.0%)、过氧化物酶体(4.5%)和未知定位(1.5%)。通过差异蛋白的功能和调控网络分析,我们发现随着NAFLD病程的进展,参与清除氧自由基相关酶、脂肪酸β氧化的相关酶及糖异生相关酶的表达逐渐降低,而脂肪形成相关酶和细胞骨架蛋白的表达逐渐升高。同时,在NASH伴早期肝纤维化阶段,星状细胞标志蛋白结蛋白(desmin)和胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein,GFAP)的表达明显增加,表明NAFLD病程向肝纤维化进一步恶化。最为显著的是脂肪代谢紊乱始终贯穿NAFLD的发生发展,特别是对NASH伴早期肝纤维化阶段差异蛋白的IPA分析,我们发现两条信号转导通路被激活,分别是Akt/PKB通路和p38MAPK通路。首先,我们在NAFLD模型中,从蛋白水平和mRNA水平验证了DIGE实验结果的可靠性;其次,采用Western blot技术检测到NASH伴早期肝纤维化阶段肝组织pho-Akt和pho-p38的表达明显增加。内脏脂肪素(Visfatin)作为一种新发现的脂肪因子,通过模拟胰岛素样作用和加重炎症反应得到人们的广泛关注。因此,我们采用免疫组化技术和酶联免疫吸附试验,检测到Visfatin不仅在NASH伴早期肝纤维化肝组织中表达明显增加,而且在其血清中也明显增高,因此我们认为Visfatin通过激活Akt/PKB和p38MAPK通路,加重肝细胞内TG的蓄积和肝组织炎症反应,从而在NAFLD发生发展中发挥着重要的作用。与此同时,我们又采用SERPA技术筛选出18个与NAFLD发展密切相关的自身抗原,通过对自身抗原α-烯醇酶(α-enolase,ENOA)和蛋白二硫键异构酶3(Protein disulfide isomerase associated 3,PDI3)的验证,我们发现抗原的形成与其在疾病状态下表达量的高低没有明显的关系。而且,我们进一步证实了NAFLD患者血清中存在抗ENOA抗体,并且抗体滴度的高低与肝细胞的损伤程度正相关。因此,本研究在蛋白整体水平挖掘了与NAFLD密切相关的自身抗原谱,为筛选潜在的NAFLD分期分型的诊断标志物提供了实验基础。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R575
【部分图文】：

游离脂肪酸,发病机制,物质代谢,脂蛋白

图INAFLD发病机制的“二次打击”学说和常用的动物模型’2首先，肝脏在糖、脂肪和蛋白质三大物质代谢中起到关键的核心作用，特别是吸纳游离脂肪酸，产生、储存和分泌脂类物质以及脂蛋白。因此，肝细胞内甘油三醋累积是NAFLD的发生发展的一个必须条件’6。然而，、恤maguchil’等认为甘油三醋具有降低游离脂肪酸肝毒性的作用，清除TG可能会加重肝脏炎症反应。其次，IR导致肝细胞内脂肪累积的机制主要包括肝外脂肪分解的增加和高胰岛素血症’8。肝外脂肪分解增加、脂肪组织对餐后游离脂肪酸的摄取和储存减少，导致过多的游离脂肪酸涌入肝脏，而胰岛素分泌过多可进一步促进血清游离脂肪酸的升高，直接造成肝毒性。此外，胰岛素分泌过多还可以通过调控脂肪形成转录因子，如固醇调节元件结合蛋白(sterolregulato叮elementbindingprotein一l，S既BP一l)、碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrateresponseelementbindingprotein，ChREBP)促进肝脏脂肪形成’9一。然而，IR并不能解释所有的NAFLD的发病机制，

脂肪,因子,血症,瘦素

图2脂肪分泌的脂肪因子23(interieukin，IL一6)等细胞因子，这些脂肪细胞因子均参与肥胖相关的炎症反应。(见图2)23。有研究报道NASH患者会出现高瘦素血症和瘦素抵抗，从而抑制胰岛素分泌的作用减弱，出现高胰岛素血症，其又可增加脂肪组织瘦素基因的表达，加剧瘦素抵抗24。但有人发现，瘦素水平与胰岛素抵抗无明显关系2，。高瘦素血症可以促进巨噬细胞分泌TNF一a、IL一6、IL一12等细胞因子，激活肝星状细胞，也可以使肝脏KuPffer细胞及窦内皮细胞产生氧化应激，并且可能激活JAK一STAT信号通路，刺激肝脏星状细胞活化，促进肝纤维化发展26。NAsH患者血清瘦素含量升高

血清转氨酶,对照组,实验组,时间点

与同期对照组相比，模型组小鼠各个时间点血清ALT、AST水平均显著升高(P<0.05);此外，造模8周后，血清ALT、AST较造模5周时明显增高(P<0.ol)(图1.3A，1.3B)。与对照组相比，模型2、5周组血清TG和TC明显下降(P<0.ol)，然后逐渐上升，但造模8周时TC仍然低于对照组(P<0.05)(图 1.3C)，而TG高于对照组(图1.3D)。与对照组相比，模型组小鼠各时间点血清Glu均显著下降(尸 <0.05)(图 1.3E)o

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