CPA1突变和剪接供体位点突变在慢性胰腺炎中的功能及其机制研究

发布时间：2020-09-11 15:08

　　第一章CPA1突变在中国汉族特发性慢性胰腺炎中的分布及其作用机制研究研究背景与目的:慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是胰腺器官的慢性炎症性疾病,最终导致胰腺不可逆的形态学改变和内外分泌功能的进行性损坏。过度饮酒是CP的首要病因,其次为分析遗传因素前尚未发现明确病因的特发性CP。2013年,《自然(遗传)》期刊报道,来自德国的一项研究首次发现编码羧肽酶A1的CPA1(carboxypeptidase A1,CPA1)功能受损性突变与CP相关。功能分析结果显示,致病性CPA1错义突变的致病机制为突变导致羧肽酶A1蛋白在内质网内错误折叠,诱发内质网应激,大量酶蛋白被破坏后分泌减少,进而发生胰腺炎。之后在日本的小样本研究和波兰、匈牙利的家系研究中均发现CP患者携带CPA1突变。然而,由于单核苷酸多态性在不同种族间具有较大差异,为证实某基因与疾病的发生发展相关,通常需要在另一种族中再次进行检测。此外,并非所有测序发现的CPA1突变都参与CP的致病过程,每个突变都需要经过功能学实验才能证实是否为致病突变。为明确CPA1突变在我国人群中的分布情况,本部分研究通过靶向测序对中国汉族特发性CP患者和健康对照人群中的CPA1基因进行检测;为明确新发突变对CP的作用情况,通过功能学实验阐明各新发突变致病与否及其致病机制。研究方法:1、获取1436例中国汉族特发性CP患者和1580例健康对照人群全血DNA,使用二代测序对CPA1外显子区域以及外显子/内含子交界处序列的突变情况进行初步鉴定,并使用一代测序进行验证,明确新发突变。2、以pcDNA3.1/V5-His TOPO为载体,使用TA克隆技术插入CPA1 cDNA序列,构建野生型CPA1 cDNA质粒。3、将新发突变通过定点突变导入野生型CPA1 cDNA质粒中,构建突变质粒。4、将质粒转染至HEK293T细胞,48小时后,提取细胞中总RNA,并逆转录为cDNA,使用常规PCR明确转录本序列,使用实时定量PCR比较突变型与野生型质粒的转录表达水平。5、通过实时定量PCR技术,比较突变型与野生型质粒内质网应激标志物Bip(HSPA5)和XBP1表达差异,明确突变质粒是否诱发内质网应激。6、通过蛋白免疫印迹实验,比较突变型与野生型质粒蛋白表达水平,明确突变质粒对蛋白表达量的影响。研究结果:1、在中国汉族特发性CP患者和健康对照人群中共检测出26种杂合子罕见错义突变,新发突变8种,其中特发性CP患者携带7种,分别为c.118AC、c.344AG、c.446GT、c.542GA、c.661AG、c.693CG、c.1213CG。2、成功构建野生型CPA1 cDNA质粒,成功构建携带新发突变的突变质粒。3、野生型CPA1 cDNA质粒表达正常转录本,突变质粒表达含突变位点的转录本。4、各突变质粒的转录本表达量与野生型质粒无明显差异。5、c.446GT、c.693CG、c.1213CG的Bip(HSPA5)和XBP1表达量明显升高,其余突变质粒的Bip(HSPA5)和XBP1表达量与野生型质粒无明显差异,说明c.446GT、c.693CG、c.1213CG诱发内质网应激,其余突变不诱发内质网应激。6、c.446GT、c.693CG、c.1213CG的蛋白表达量明显降低,其余突变质粒的蛋白表达量与野生型质粒无明显差异,结合上述研究结果,说明c.446GT、c.693CG、c.1213CG因诱发内质网应激导致大量酶蛋白被破坏后表达减少,与CP致病相关;其余新发突变c.118AC、c.344AG、c.542GA、c.661AG对CP无致病作用。研究结论:1、中国汉族人群中特发性慢性胰腺炎患者的遗传背景与欧洲人群有很大不同,CPA1突变具有明显的种族特异性。2、在中国汉族人群中检测出的新发突变,部分因内质网应激导致大量酶蛋白被破坏后表达减少,参与慢性胰腺炎的致病。第二章CPA1功能缺失型突变在慢性胰腺炎中的作用机制研究研究背景与目的:既往发现多种基因参与了慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)的致病过程,Nemeth等制作了CP相关基因数据库http://www.pancreasgenetics.org/,收录了PRSS1、PRSS2、SPINK1、CTRC、CPA1五种CP相关基因的信息。目前已发现CP患者携带的CPA1非同义突变包括错义突变、无义突变、移码突变、剪接位点突变。不同于单个氨基酸改变的错义突变,功能缺失型突变(即无义突变、移码突变和剪接位点突变)造成读码情况大范围改变,转录出的异常mRNA和翻译出的异常蛋白与正常相比有很大差异。致病性CPA1突变触发胰腺炎的前提是表达足量羧肽酶A1蛋白,蛋白在内质网内错误折叠后在细胞内积聚,诱发内质网应激,大量酶蛋白被破坏后分泌减少,进而发生胰腺炎。而功能缺失型突变表达的异常mRNA可能会诱导无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD),清除此类异常mRNA,防止翻译出大量结构和功能异常的蛋白。因此,我们推测CPA1功能缺失型突变由于NMD从而导致mRNA和蛋白产量显著减少,不足以诱发内质网应激,与CP的致病作用无关。为明确CPA1功能缺失型突变在CP中的作用,本部分研究通过CP相关基因数据库筛选出此类突变,并通过功能学实验和生物信息学预测软件探讨突变致病与否及其机制。研究方法:1、在CP相关基因数据库中检索CPA1功能缺失型突变。2、以pc DNA3.1/V5-His TOPO为载体,使用TA克隆技术插入CPA1全长基因序列和c DNA序列,构建野生型CPA1全长基因质粒和c DNA质粒;以p ET01为载体,使用In-Fusion克隆技术插入CPA1外显子3及其邻近序列和外显子9及其邻近序列,构建野生型CPA1 minigene质粒。3、将无义突变通过定点突变导入野生型CPA1 c DNA质粒中,将剪接位点突变通过定点突变导入野生型CPA1 minigene质粒中,构建突变质粒。4、将质粒转染至HEK293T细胞,48小时后,提取细胞中总RNA,并逆转录为c DNA,使用常规PCR明确无义突变质粒和剪接位点突变质粒的转录本序列。5、针对无义突变,使用实时定量PCR比较突变型与野生型质粒的转录表达水平、突变质粒转录本在使用NMD抑制剂放线菌酮前后表达量的差异、突变型与野生型质粒内质网应激标志物Bip(HSPA5)和XBP1表达差异,明确突变质粒是否受NMD作用、是否诱发内质网应激。6、针对无义突变,通过蛋白免疫印迹实验,比较突变型与野生型质粒蛋白表达水平,明确突变质粒对蛋白表达量的影响。7、针对剪接位点突变,使用Alamut Visual软件预测突变对前体mRNA剪接作用的影响。研究结果:1、分析CP相关基因数据库中关于CPA1基因的既往研究后,获取了CPA1功能缺失型突变,包括无义突变c.79CT、c.357CA、c.954_955del CA和剪接位点突变c.148-1GA、c.1072+1GT、c.1073-2AG。2、成功构建野生型质粒,使用野生型CPA1 c DNA质粒构建c.79CT、c.357CA、c.954_955del CA的突变质粒,使用野生型CPA1 minigene质粒构建c.148-1GA、c.1072+1GT的突变质粒。3、无义突变c.79CT、c.357CA、c.954_955del CA的质粒表达含突变位点的转录本;剪接位点突变c.148-1GA导致转录本缺失外显子3前65 bp序列,c.1072+1GT导致转录本外显子9跳跃。4、无义突变c.79CT、c.357CA、c.954_955del CA的质粒转录本表达量减少,在使用NMD抑制剂放线菌酮后表达量升高,说明突变质粒转录本表达受NMD作用而减少;Bip(HSPA5)和XBP1表达量减少,说明突变质粒不诱发内质网应激。5、无义突变c.79CT、c.357CA、c.954_955del CA的蛋白表达量明显降低,结合上述研究结果,为转录本表达量减少所致,与诱发内质网应激导致蛋白破坏无关,说明突变对CP无致病作用。6、剪接位点突变c.148-1GA、c.1072+1GT使终止密码子提前出现,推测其转录本因NMD作用而表达降低,翻译产物不足以诱发内质网应激,与CP的致病作用无关。7、Alamut Visual软件预测剪接位点突变后失去剪接功能,但不能准确预测突变后新出现的剪接位点。研究结论:1、CPA1功能缺失型突变(包括无义突变和剪接位点突变)的转录本表达因无义介导的mRNA降解而减少,翻译出的异常蛋白含量不足以诱发内质网应激,与慢性胰腺炎的致病作用无关。2、生物信息学预测软件尚不能准确预测剪接位点突变后的剪接情况,功能学实验仍是目前的金标准。第三章剪接供体位点GTGC突变后表达情况及其在慢性胰腺炎相关基因中的应用研究背景与目的:编码基因的表达需要经过转录和翻译两大过程。转录后产生的前体mRNA需要经过剪接作用去除内含子,形成成熟mRNA,才可以进行下一步的翻译。外显子最后3 nt序列与紧随其后的U2型内含子前6 nt序列共同组成的U2型剪接供体位点(splice donor site,SDS)9 nt序列相对保守,此序列中位于内含子前两位的GU(GU为RNA上的序列,对应基因上的序列为GT)对于剪接位点识别和剪接过程具有重要作用。中国汉族慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)患者中携带最多的突变为SPINK1内含子3上+2位的T突变为C(表示为IVS3+2TC或c.194+2TC),此突变为剪接位点突变,导致SDS上的GT被GC替代(称为SDS GTGC突变),除发生异常剪接外,仍然可以通过正常剪接表达野生型转录本,保留翻译出正常蛋白的功能。除CP中的SPINK1外,某些疾病相关基因的SDS GTGC突变后也能表达野生型转录本,但此现象在整个人类基因组中的情况至今尚未知晓,目前在CP中关于SDS GTGC突变的研究也仅限于SPINK1的IVS3+2TC,其他CP相关基因(PRSS1、PRSS2、CTRC、CPA1)在发生此类突变后的转录本表达情况尚未报道。发现CP相关基因SDS GTGC突变后仍能表达野生型转录本的突变位点,将有助于准确理解此突变导致的临床意义,为CP的临床诊疗提供巨大帮助。本部分研究通过整合在体数据集和体外数据集的结果,明确人类基因组中SDS GTGC突变产生野生型转录本的情况;通过SDS 9 nt序列分析图,预测CP相关基因SDS GTGC突变对剪接作用和临床表型的影响。研究方法:1、检索人类基因突变数据库专业版中记录的致病SDS GTGC突变,将其作为在体数据集,得知SDS GTGC突变产生野生型转录本的发生频率及其表达水平。2、以pc DNA3.1/V5-His TOPO为载体,使用TA克隆技术插入全长基因序列;以pc DNA3.1(+)为载体,使用In-Fusion克隆技术插入全长基因序列,构建野生型全长基因质粒。3、将SDS GTGC突变通过定点突变导入野生型全长基因质粒中,构建突变质粒。4、将质粒转染至HEK293T细胞,48小时后,提取细胞中总RNA,并逆转录为c DNA,使用常规PCR明确突变质粒的野生型转录本表达情况,作为体外数据集。5、整合上述两个数据集的结果并绘制SDS 9 nt序列分析图,预测CP相关基因SDS GTGC突变对剪接作用和临床表型的影响。研究结果:1、在体数据集45个致病SDS GTGC突变中7个(15.6%)表达野生型转录本,体外数据集103个SDS GTGC突变中19个(18.4%)表达野生型转录本。2、体外数据集中的功能实验证实SPINK1 IVS3+2TC可以表达野生型转录本而PRSS2的4个SDS GTGC突变均不能表达野生型转录本。3、序列分析图显示,SDS GTGC突变后能表达野生型转录本的SDS 9 nt序列与U1 sn RNA上的5'端序列具有更强的互补性,并存在保守序列ag GUAAG。4、结合序列分析图的结果,预测CPA1 IVS5+2TC和CTRC IVS2+2TC能表达野生型转录本而PRSS1的4个SDS GTGC突变均不能表达野生型转录本。研究结论:1、剪接供体位点GT突变成GC后,仍有部分突变能产生野生型转录本。2、慢性胰腺炎相关基因剪接供体位点GTGC突变后,部分可以表达野生型转录本,保留产生正常蛋白的功能,其临床症状较轻,预后较好。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R576
【部分图文】：

质粒,标志物,转录本,野生型

图 1-1 突变质粒转录本相对表达量变质粒内质网应激标志物表达情况量 PCR，比较新发突变质粒内质网应激标志物表表达量之间的差异。以野生型质粒内质网应激标，c.118A>C、c.344A>G、c.446G>T、c.542G>A、c.6613C>G 突变质粒的内质网应激标志物 Bip（HSPA55%、103.70%±21.26%、214.99%±49.67%、108.03%0%±35.23%、267.21%±37.96%、263.39%±17.39对表达量分别为 108.46%±19.70%、109.99%±2±18.75%、105.86%±36.66%、144.11%±46.57%、，如图 1-2 所示。除阳性对照 c.768C>G 外，c.446p（HSPA5）和 XBP1 表达量明显升高，其余突变质粒野生型质粒无明显差异。

标志物,质粒,野生型

图 1-1 突变质粒转录本相对表达量（五）新发突变质粒内质网应激标志物表达情况通过实时定量 PCR，比较新发突变质粒内质网应激标志物表达量与野生型质粒内质网应激标志物表达量之间的差异。以野生型质粒内质网应激标志物表达量为参照（设定值为 100），c.118A>C、c.344A>G、c.446G>T、c.542G>A、c.661A>G、c.693C>G、c.768C>G、c.1213C>G 突变质粒的内质网应激标志物 Bip（HSPA5）相对表达量分别为 96.43%±32.65%、103.70%±21.26%、214.99%±49.67%、108.03%±34.93%、115.6±26.55%、178.00%±35.23%、267.21%±37.96%、263.39%±17.39%；另一内质网应激标志物 XBP1 相对表达量分别为 108.46%±19.70%、109.99%±20.77%、228.10%±53.09%、101.47%±18.75%、105.86%±36.66%、144.11%±46.57%、220.38%±15.54%227.07%±31.53%，如图 1-2 所示。除阳性对照 c.768C>G 外，c.446G>T、c.693C>G、c.1213C>G 的 Bip（HSPA5）和 XBP1 表达量明显升高，其余突变质粒的 Bip（HSPA5）和 XBP1 表达量与野生型质粒无明显差异。

质粒,患者,蛋白表达,野生型

（六）新发突变质粒蛋白表达情况通过蛋白免疫印迹实验，比较新发突变质粒蛋白表达量与野生型质粒蛋白表达量之间的差异，如图1-3所示，除阳性对照c.768C>G外，c.446G>T、c.693C>G、c.1213C>G的蛋白表达量明显降低，其余突变质粒的蛋白表达量与野生型质粒无明显差异。图 1-3 突变质粒蛋白表达量（七）明确新发突变质粒的突变类型通过上述实验，明确了表 1-1 中 ICP 患者携带的 7 种新发突变致病与否及其致病机制：c.118A>C、c.344A>G、c.542G>A、c.661A>G 不致病；c.446G>T、c.693C>G、c.1213C>G 因内质网应激导致蛋白表达降低，与 CP 发病相关，详见表 1-3。表 1-3 中国汉族特发性慢性胰腺炎患者新发突变致病情况外显子碱基改变氨基酸改变 ICP 患者数对照人群数致病情况2 c.[118A>C];[=] p.Lys40Gln 1 0 不致病3 c

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