乙型肝炎病毒变异与慢加急性肝衰竭发病关系的研究

发布时间：2020-09-21 13:08

　　背景：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是世界范围内导致病毒相关性慢性肝脏疾病最常见的原因之一。据估计全世界约有3亿慢性HBV携带者,我国的HBV感染者约为1.2亿。慢性HBV感染可引起包括无症状携带、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)、肝硬化和肝癌,或进展为肝衰竭(liver failure, LF)的一系列肝脏疾病谱。慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)是在慢性乙肝病毒感染基础上,由于病毒复制、感染、内毒素血症及劳累饮酒等诱因,引起的肝脏急性炎症加重,肝脏发生大块或亚大块坏死,导致病情急剧加重,引起肝衰竭。中国80%的ACLF患者与HBV感染相关。ACLF的死亡率很高,在未进行肝移植的患者中高达(60-80)%。在CHB基础上进展为肝衰竭的机制复杂,HBV病毒和机体免疫的因素都起着重要的作用。既往文献报道HBV病毒变异,特别是前C区终止密码子(G1896A,PC)和基本核心启动子(basie core promoter, A1762T/G1764A, BCP)的变异率在急性肝衰竭的患者中明显升高；PC和BCP变异下调了作为免疫耐受原的HBeAg,血清中HBeAg下降或缺如,导致HBcAg表达增加,使Th1辅助细胞发动细胞毒性T细胞(cytoxic T lymphocyte, CTL)攻击感染的肝细胞,从而导致肝细胞坏死。 HBcAg作为CTL靶抗原,包含有多个能被CTL识别的表位(epitope)。表位是特异性细胞免疫应答得以激发的主要原动力,处于免疫识别和免疫激活的核心位置。核苷酸的转换、插入和缺失可导致氨基酸的有义突变,当这种突变影响到病毒的特异性T淋巴细胞和B淋巴细胞表位的序列和序列构象时,进一步会影响与HLA分子的结合力或与B、T淋巴细胞受体的结合力,从而影响宿主针对病毒的免疫应答能力。在一些肿瘤和其他病毒细胞免疫应答方面,研究已证实基因变异会导致T细胞表位漂移(epitope drift),从而改变了表位的免疫原性,进而影响疾病的发展与预后。目的：以中国广东地区ACLF患者为主要对象,从HBV变异影响基因转录调控和影响宿主免疫应答两个方面,探讨病毒变异与ACLF患者发病的关系。方法： 39例ACLF患者和38例严重肝炎活动患者(severe hepatitis B, SHB)作为主要研究对象。其中ACLF诊断标准：在慢性肝病的基础上急性起病,15天至26周出现以下临床表现者：①极度乏力,有明显的消化道症状；②黄疸迅速加深,血清总胆红素(TB)≥正常值上限10倍,或每日上升≥17.1μmol／1；③凝血酶原时间明显延长,凝血酶原活动度(PTA)≤40%。SHB定义参照文献的报道：丙氨酸转氨酶(ALT)≥600U／l、TB≥51.3μmol／l和PTA≤50%。作为对照组的44例CHB患者定义为：HBV表面抗原(HBsAg)阳性半年以上,出现的轻度或中度肝炎活动,即ALT波动于(80-400)U／l和TB≤17.1μmol／l。以上患者临床和实验室检查均无明显肝硬化征象。ACLF和SHB的患者平均随访10.6月(最长17个月,最短3个月)。采集患者的临床资料和血清标本。抽提DNA,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增和测序HBV前C／C区,通过克隆测序的方法对HBV混合株感染加以验证。通过生物预测网站SYFPEITHI和BIMAS分析线性Th细胞表位和CTL表位发生变异后与HLA分子的结合能力,用HBcAg X线衍射3D结构分析B细胞表位变异后构型的改变。用五聚体染色(pentamer staining)技术探讨表位免疫原性的改变。结果： 1)临床资料的比较：ACLF组与SHB组比较TB的水平明显升高,而ALB及PTA均降低；差异均有统计学意义；反映肾功能的指标血肌酐(Cr)(99.4±94.7vs.75.0±14.1；P0.001)和判断是否合并感染的指标白细胞总数(WBC)[8.0±3.2(×109／l)vs.6.2±2.1(×109／l)；P=0.005]在ACLF组也升高。两组之间HBV基因型分布和BCP、PC变异发生率均无明显差异。ACLF中死亡组与存活组相比：PTA明显降低,WBC明显升高,差异均有统计学意义；Cr也较存活组高,但无显著性差异(P=0.072)。 2)HBV基因型：ACLF和SHB两组均以基因B型和C型为主,有1例患者为基因D型；5例患者由于HBV DNA定量低,PCR扩增失败未鉴定基因型,未纳入统计。其中基因B型比率分别高达(26／35,72.2%)和(24／36,68.6%),均高于CHB组(22／44,50%)。SHB组与CHB比较有统计学差异(P=0.044)；ACLF组也较CHB组升高,但无统计学意义(P=0.069)。 3)C基因调控区变异 (1) BCP(A1762T/G1764A)的变异率在ACLF中明显高于CHB组(56.7% vs.32.4%,P=0.046),PC(G1896A)变异率也显著高于CHB组(50% vs.15.9%,P=0.003)。用“-”表示未变异,用“+”代表变异来进行简化；ACLF组HBV发生BCP-/PC+和BCP+/PC+的比例明显高于CHB组,而BCP-／PC-的比例明显低于CHB组。 (2)在BCP+/PC-、BCP-/PC-、BCP-/PC+和BCP+／PC+模式中HBeAg的阴性率逐步升高,分别为在40%、53%、76.5%和83.3%；而且BCP-／PC+和BCP+/PC+模式下调HBeAg的作用比其他两种模式明显增强；在单变异模式中PC变异下调HBeAg的作用较BCP变异明显(P=0.001)。 (3)nt1846 A-T变异的发生率在ACLF组明显高于SHB组[80.6%(25／31)vs.16.7%(5／30),P0.001]及CHB组[80.6%(25／31)vs.11.1%(4／36),P0.001]。而该变异位点与本研究中患者的基因型分布无相关性。 (4) BCP-/PC-模式中HBeAg阴性率在四种模式中并非最低；进一步分析在这种模式中ACLF的患者均为HBeAg阴性。而这部分ACLF的患者HBV DNA定量与该模式中SHB的患者无差异。 4) C基因编码区变异 (1)C基因编码区氨基酸发生变异的频率在ACLF组明显高于CHB组。在ACLF中氨基酸变异率超过10%,且与CHB组比较有统计学差异的共有7个位点。这些高频率的变异位点绝大部分位于表位区域：aa5、aa35和aa60分别位于的Thl-20、Th35-45和Th49-69辅助细胞表位区,aa27位于CTL18-27细胞毒性T细胞表位区,aa83和aa135分别位于B76-87和B130-135表位区。进一步统计以上表位区变异的频率显示：ACLF在各个表位区变异频率均高于CHB组。 (2)aa5和aa60变异存在明显的相关性,Pearson相关系数为0.632(P0.001)。并且这两点在随访中表现为协同共变异：即aa5位氨基酸发生P-T的变异,同时观察到aa60发生L-V的变异；或aa5 T-P协同aa60 V-L。HBcAg晶体3D结构显示,aa5和aa60在空间构型上位置相邻,分享同一个四螺旋束(four-helix bundle)。网站预测aa5和aa60所在的肽段作为潜在的CTL表位与HLA分子的结合力,显示aa5发生P-T的变异后引起所在的肽段与HLA-A*0201分子的结合分数升高了3分(13 vs.16)；而aa60 L-V的变异后所在肽段与HLA-A*0201分子的结合分数降低。 (3)对于高变异位点所位于的已知线性Th细胞表位和CTL表位通过生物学网站预测其免疫原性的改变；对于空间构象型B细胞表位用HBcAg X衍射3D结构分析其构型的改变。通过HBcAg晶体结构分析构象性B细胞表位显示,高变异位点所在的B细胞表位均位于HBcAg结构中向外侧突出的位置；而在B细胞表位HBcAg130-135中,aa135处于最向外突出的点。CTL表位HBcAg18-27发生27位I-V的变异后,SYFPEITHI评分显示与HLA-A*0201分子的结合分数升高了2分(24 vs.22)；BIMAS评分显示HBcAg18-27(V27)与HLA-A*0201结合的分数为2309.961,而I27为346.494。 5)表位HBcAg18-27 (1)HLA-A*0201限制性特异性CTL表位HBcAg18-27,在中国I27的背景下,ACLF组V27变异率高。在ACLF组V27的发生率明显高于CHB组,差异有统计学意义[10／39(25.6%)vs.3／44(6.8%)；P=0.019]；同样,SHB组V27的比率也高于CHB组[8／38(21.1%)vs.3／44(6.8%)；P=0.059]。 (2)为了探讨表位HBcAg18-27的动态变化,随访了SHB和ACLF组中10例发病时V27单一病毒株感染或V27和I27混合株感染的患者,及19例发病时I27单一病毒株感染的患者。在4例HLA-A2阳性的患者中无论发病时是V27单一病毒株感染或是V27和I27混合株感染,随访后均变异成I27单一病毒株感染；而在5例HLA-A2阴性患者中,随访后包含V27的病毒仍能检测出。进一步的克隆测序,验证了V27向I27转换的变异模式。而18例发病时感染I27单一病毒株的患者随访后仍然为单一I27病毒株感染。 (3)用五聚体技术,分析HBcAg18-27表位变异后免疫原性的差异。分离HLA-A2阳性ACLF和SHB患者的PBMC,用HBcAg18-27两种形式(I27和V27)的特异性五聚体直接检测分析特异性CD8细胞的频数；直接检测的结果显示特异性CD8细胞的频数较低,两组之间无统计学差异。对于直接检测后仍有余留PBMC的患者,将其PBMC增殖培养13天后再进行五聚体染色：在案例报道中显示HBcAg18-27(V27)特异性CD8细胞的频数高于HBcAg18-27(127)特异性CD8细胞的频数。 (4)在ACLF和SHB的患者中,aa27V患者HBV DNA定量低于aa27I的患者,尽管差异无统计学意义(P=0.093)。而ACLF组HBV DNA定量明显低于CHB组[(5.75±1.73 vs.9.16±1.72)log10 copies/ml；P0.001],SHB组也低于CHB组[(5.55±1.61 vs.9.16±1.72)1og10copies/ml；P0.001]. 结论： 1)与从SHB进展为ACLF相关的因素包括：TB、Cr和WBC的升高,ALB和PTA的降低。在ACLF中,PTA下降及WBC升高与不良结局相关。 2)基因B型在ACLF和SHB两组比率均高于CHB组,且SHB组与CHB组比较有统计学意义。这表明在中国南方地区基因B型与严重的肝脏炎症活动发病相关。 3) BCP(A1762T/G1764A)和PC(G1896A)变异率在ACLF组明显高于CHB组。ACLF组HBV发生BCP-／PC+和BCP+／PC+的比例明显高于CHB组,而BCP-／PC-比例明显低于CHB组。这个结果证实了A1762T／G1764A和G1896A高变异与ACLF发病的相关性。 4)在BCP+/PC-、BCP-/PC-、BCP-/PC+和BCP+/PC+模式中HBeAg的阴性率逐步升高；而且BCP-／PC+和BCP+／PC+模式下调HBeAg的作用与其他两种模式相比明显增强；在单变异模式中PC变异下调HBeAg作用强于BCP变异；且在ACLF组BCP+／PC+和PC单变异的比例明显高于CHB组。这表明PC+和BCP+／PC+模式导致的HBeAg与ACLF发病相关。 5)C基因编码区发生变异的频率在ACLF组明显高于CHB组。ACLF中氨基酸变异率明显升高的位点绝大部分位于表位区域。统计各个表位区变异的频率,在ACLF组均高于CHB组。这说明表位变异可能在ACLF发病中起着重要的作用。 6)aa5和aa60变异存在明显的协同关系。两位点尽管在线性位置相隔远,但在HBcAg空间构型上位置相邻,分享HBcAg四聚体中同一个螺旋束。通过预测分析肽段发生aa5 P-T的变异后与HLA-A*0201结合力增强；提示aa5变异后可能提高表位的免疫原性、诱导更强的免疫反应；而aa5 P-T的变异在ACLF中明显升高(52.63%)；表明aa5T与ACLF的发病相关。aa60由于与aa5空间位置相邻,可能在极性、PH值、亲水性等多个因素的影响下,出现协同变异。 7)HLA-A2限制性CTL表位HBcAg18-27(V27)在ACLF组的比率明显升高,且随访后ACLF患者中,HLA-A2阳性的患者均变异I27；且HBcAg18-27(V27)特异性CD8细胞的频数高于HBcAg18-27(127)特异性CD8细胞的频数。这表明HBcAg18-27(27V)在HLA-A2阳性患者中引起较强的免疫应答,在清除了aa27V病毒的同时,导致了肝脏炎症的发生,与ACLF的发病相关。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R575.3
【部分图文】：

核酸DNA,HBV感染,正链,复制过程

调节cp和xp，也调节sp。Enhll位于ntl685一773，紧连BCP的上游与CuRS重叠。Ehnll调节cP和前sPZ的转录，优先顺势激活sPI。图1一 1HBv基因组的结构Figl一 1StruetureofHBVgenome在HBV感染和复制过程中，病毒粒子通过外膜蛋白的前S1区首先与肝细胞表面的未知受体接触，侵入胞浆的病毒脱壳后，核酸DNA进入细胞核，正链

复制模式,肝细胞

第一章研究背景延长成为完整双链，经DNA多聚酶补齐缺口成熟为共价闭合环状valentclosedcircularDNA，cceDNA)，作为转录模板合成不同长度的，进入胞浆翻译为病毒的各种蛋白质，另有一部分3.skb的m丑NA作为基因组首先与P蛋白结合，再被二聚体形式的核壳蛋白包装形成核心颗基因组在核心颗粒内逆转录为松弛环状DNA(relaxedcircularDNA，)，一部分核心颗粒重新进入细胞核补充核内cccDNA池，其余核心颗粒s的presl区结合，在内质网获得包膜，再出芽分泌至细胞外(图1一2)。

过程图,效应,过程,表位

10个氨基酸;MHC一n类分子限制性表位一般长巧个氨基酸左右。T细胞表位和HLA分子共同决定了何种T细胞受体(TCR)被激活，决定了何种T细胞克隆得以活化和增殖[’8](图1一3)。HBv发生核昔酸的转换、插入或缺失，倘若作为有义突变则影响氨基酸的编码，可能引起表位序列的变异。HBcAg上表达很多的抗原表位，CTL对HBV表位的应答强度对疾病进展产生重要影响:倘若反应不足，病毒难以清除使感染慢性化;如果反应过强，导致肝细胞广泛损伤引起病情加重，严重者造成肝衰竭。图1一 3HBv特异性细胞免疫应答的发生和效应过程Figurel一 CellularimmuneresPonsesofHBV注:图引至GanemD， NEnglJMed

【参考文献】