乙型肝炎病毒突变与肝细胞癌关系的研究

发布时间：2020-09-21 14:16

　　研究目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染的常见结局是从无症状携带者发展为慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌,是由乙肝病毒、宿主和环境相互作用的结果。病毒因素包括HBV的基因突变、基因型、病毒载量和HBeAg状态等,其中HBV基因突变是影响病毒生物学特性的重要因素之一,常见的突变包括前S区的PreS 1和PreS 2缺失突变、BCP区的T1762/A1764双突变、前C区的A1896突变等,HBV突变有可能改变病毒的复制能力和致病性、改变抗原表位而影响免疫应答反应、产生抗病毒药物耐药性等,既有可能引起持续感染,又有可能造成严重的肝细胞损伤。国内外已有一些文献报道了HBV基因突变与肝细胞癌的关系,研究表明前C区和BCP区某些突变可以影响HBeAg的表达、分泌或增加病毒复制能力,然而对前C区和BCP基因突变与肝癌关系的研究结果并不一致,对前S区的突变研究还比较有限,对上述观点也有争议,这可能与分析的样本量较小以及研究设计类型有关。本研究旨在通过病例对照研究方法和Meta分析进一步探讨HBV突变与肝细胞癌发生之间的关系。研究方法:本研究以肝细胞癌患者为病例、选取慢性乙型肝炎(CHB)患者和无症状携带者(ASC)为对照,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,应用巢式PCR扩增,对PCR产物进行DNA测序,进行多位点突变检测,用MEGA 4.0、DNASTAR 5.0和Bioedit 7.0软件分析比对结果。通过对比分析HCC患者和CHB患者和ASC样本HBV在前S区和核心启动子区(Core promoter,CP)及前C区多个位点的突变发生率,分析HBV前S区、前C区和CP区基因突变与肝细胞癌的关系。Meta分析使用Cochrane协作网(www.cochrane.org)提供的Review Manager(RevMan)5.0和统计分析软件Stata 9.1同时进行,系统全面检索相关文献、制定纳入、排除标准和文献质量评价表、评价文献质量、统计分析集中报道的多个HBV突变位点,尤其是报道不一致的突变位点,期望通过扩大样本量得到一个更加可靠的关于HBV突变与HCC关系的结论。使用Stata 9.1和SPSS 16.0软件进行卡方检验、T检验和多因素Logistic回归等统计分析。研究结果:本研究对象均为成年患者,收集659例HCC、425例CHB、836例ASC血清标本,提取HBV DNA,成功扩增并且检测出HBV前S和CP区HCC序列292条、CHB序列240条和ASC序列240条。 1、前S区的缺失和突变结果: (1)前S区PreS1、PreS2缺失突变、起始密码子缺失突变和点突变: HCC共发生缺失突变79例,HCC和CHB两组PreS区缺失突变比较,OR=2.16(1.17,4.00)。HCC和CHB中缺失类型均以preS2的5’端缺失最为多见。 (2)比较HCC和CHB两组前S区的点突变,检测HCC和CHB两组PreS区C2857、A2875、T2931、T2940、A2946、A2950、A2951、G2962、A2964、T3026、T3051、T3054、T3060、A3063、A3066、T3026、T3054、T3060、A3066、G3069、T3116、A3120、G3186、C3191、T3216、C3222、T3225、C3246、G3264、C3267、C3268、A3291、T3320、T3324、T3350共35个点突变比较发现,T2940、A2946、G2962、A2964、A3120、C3191、C3246、C3267、C3268、T3350共10个位点突变有意义。其中A2946、A3120、C3191、C3246、C3267五个位点的OR1,提示有保护作用。其它5个位点的OR1,可能是潜在的危险因素。 (3)对不同基因型中HCC组和CHB组PreS区基因突变比较分析对CHB组中基因型B和基因型C两组PreS区基因突变比较,有T2931、A2946、A2950、A2951、G2962、A2964、T3026、T3054、T3060、A3066、G3069、T3116、A3120、G3186、C3191、C3222、T3225、C3246、G3264、A3291、T3320、T3324、T3362多个突变位点具有统计学差异。对基因型C中HCC组和CHB组PreS区基因突变进行了比较,其中A2951、G2962、A2964、T3054、T3060、A3066、G3069、T3225、C3246、C3268、A3291、T3350等12个位点突变具有统计学差异。 (4)对不同HBeAg状态中HCC组和CHB组PreS区基因突变比较分析对CHB组HBeAg(+)和HBeAg(-)的PreS区基因突变比较,其中A2950、C3267、C3268有统计学差异。对HBeAg阳性中HCC组和CHB组PreS区基因突变比较,其中T2940、A2946、G2962、A2964、A3063、A3066、A3120、C3191、T3225、C3267、C3268、T3350位点突变具有统计学差异。对HBeAg阴性中HCC组和CHB组PreS区基因突变进行了比较,G2962、A2964位点突变具有统计学差异。 (5)HCC和CHB两组PreS1和PreS2区起始密码子缺失和突变分析, HCC组以PreS2起始密码子缺失13例,突变36例,突变中以ATG突变为ATA最多;CHB组PreS2起始密码子突变6例,两组PreS2起始密码子缺失和突变的OR=15.64[6.39,38.28]。HCC组PreS1起始密码子缺失4例,突变2例,CHB组PreS1起始密码子缺失2例,突变1例,PreS1起始密码子缺失和突变的OR=2.44[0.60,9.97]。 2、前C区和CP区基因突变分析 (1)前C区和CP区基因点突变分析: 检测前C区与CP区G1652、T1653、T1673、C1674、T1719、C1726、T1727、G1730、V1753、T1762、A1764、T1766、G1799、A1896、A1899和A1913共16个位点的突变差异。①HCC与CHB组比较,OR1的位点有:T1653、C1674、V1753、T1762、A1764、T1766、A1896、A1899。②HCC和ASC组比较,OR1的位点:T1653、V1753、T1762、A1764、A1896、A1899;而OR1的位点有:T1719、T1727、G1799。③CHB和ASC组比较,OR1的位点:T1653、V1753、T1762、A1764、A1896;OR1的位点:T1719、T1727、G1730和G1799。 (2)不同基因型之间比较: 基因型B中,HCC与CHB和ASC比较,C1726、T1727、T1762、A1764有统计学差异;基因型C中,HCC与CHB和ASC比较,T1653、T1719、T1727、G1730、V1753、T1762、A1764、A1896、A1899位点突变率有统计学差异;HCC组中,基因型B与基因型C比较,G1652、T1653、T1673、C1674、T1719、C1726、G1730、V1753、T1762、A1764、G1799位点突变率有统计学差异,其中基因型B高于基因型C的位点:G1652、T1673、C1726、G1730、G1799,基因型C高于基因型B的位点:T1653、C1674、T1719、V1753、T1762、A1764;CHB组中,基因型B与基因型C比较,G1652、T1653、C1674、T1719、C1726、T1727、G1730、T1762、A1764、G1799位点突变率有统计学差异,其中基因型B中突变率高于基因型C的位点:G1652、T1673、C1726、T1727、G1730、G1799,基因型C高于基因型B的位点:C1674、T1719、T1762、A1764,而T1653、V1753突变率无统计学差别;ASC组基因型B中突变率高于基因型C的位点:C1726、T1727、G1730、G1799、A1896、A1899,基因型C高于基因型B的位点:T1719,而T1762、A1764突变率无统计学差别。 (3)不同HBeAg之间比较: 在HBeAg(+)的HCC组和CHB组比较,T1653、V1753、T1762、A1764、A1896、A1899位点的突变率有统计学差异;在HBeAg(-)的HCC组和CHB组比较,T1653位点的突变率有统计学差异;HCC组不同HBeAg状态PC/BCP/EnhⅡ区基因突变比较,在A1896、A1899位点有统计学差异;CHB组不同HBeAg状态PC/BCP/EnhⅡ区基因突变比较,在T1653、T1719、C1726、T1727、G1730、V1753、T1762、A1764、A1896、A1899位点有统计学差异。 (4)联合突变比较分析: 在HCC、CHB、ASC三组突变率有统计学差异的位点中,分析多个位点联合突变的组合模式和发生情况。CHB组中野生型的比例(67.51%)明显高于HCC组(28.85%)。双突变中HCC、CHB和ASC组中均以T1762/A1764最为常见,分别占75.48%、44.67%和18.75%。HCC与CHB、ASC两组或三组卡方检验,野生型、双突变和三突变均具有统计学差异。 3、单因素和多因素Logistic分析: ①HCC组和CHB组比较,采用平行分组的单因素Logistic回归分析。筛选出有意义的变量:Age、Gender、HBeAg、AFP、ALT、T1653、V1753、T1762、A1764、T1766、T1727、A1896、A1899、C1674、PreS、C3222、A3063、A312、T3051、T3116、T3216、G2962。②将单因素Logistic回归分析筛选的变量纳入多因素Logistic回归分析,采取逐步回归的方法,进一步筛选多元回归变量,最后HCC和CHB组比较,HCC的发生与C1674、T1766、A1899、V1753和G2962等多个位点突变及年龄、HBeAg、HbcAb等危险因素有关。3、Meta分析, (1)突变位点的合并OR值根据文献纳入标准和排除标准,共纳入文献43篇,其中病例对照研究40篇,队列研究3篇。累计纳入分析2720例HCC病例和6059例对照,6个突变位点合并的OR和95%CI分别是:PreS:OR=3.77,95%CI(2.57-5.52),T1653:OR=2.76,95%CI(2.09-3.64),V1753:OR=2.35,95%CI(1.63-3.40),T1762/A1764:OR=3.79,95%CI(2.71-5.29)。其中T1653,V1753和T1762/A1764位点的合并OR值HBeAg(+)组高于HBeAg(-),低质量文献组高于高质量文献组,在基因型之间也存在差异。而A1896:OR=1.15,95%CI(0.83-1.60)和T1858:OR=1.14,95%CI(0.39-3.29)突变与HCC发生无明确的统计学差异。 (2)发表性偏倚和敏感性分析对各个分析合并的位点利用Egger检验和漏斗图进行发表性偏倚分析,只有Pres位点存在发表性偏倚,Egger's test:P=0.01,95%CI(1.286,6.798),漏斗图不对称,存在发表性偏倚。其余各个位点漏斗图基本对称,Egger检验P0.10。敏感性分析少数位点对某些研究比较敏感,但是不会对结果造成明显影响,不会逆转结果。 (3)联合突变分析基因突变对诊断和预测HCC的评价 PreS,T1653,V1753和T1762/A1764从ASC、CHB、LC、HCC发展过程中突变不断累积,突变率逐渐增加(Ptrend0.001),T1762/A1764对预测HCC有较高的特异性,其灵敏度为70.6%,特异度为60.6%;而T1762/A1764+T1653联合突变的灵敏度为43.4%,特异度为84.2%;T1762/A1764+V1753联合突变的灵敏度为51.7%,特异度为80.4%;T1762/A1764+T1653+V1753联合突变的灵敏度为24.3%,特异度为93.9%。联合突变可明显提高预测HCC的特异性,但是灵敏度也随之降低。从ASC向CHB、LC、HCC发展过程中,HBV的突变率逐渐增加,PreS位点突变率从10%到48.20%,而T1762/A1764位点各阶段突变率分别为28.26%,49.87%,70.55,70.64%。研究结论:HBV PreS,T1653,V1753和T1762/A1764突变增加HCC发生的危险,这些单个或联合突变对早期检测和发现HCC有重要临床意义,检测这些突变有利于抗病毒治疗的筛选和HCC预测。需要进一步研究这些突变与宿主的相互作用和发展检测这些突变的方法用于预测HCC。
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R512.6;R735.7
【部分图文】：

乙型肝炎病毒,感染率,肝硬化,血清流行病学调查

前言全世界大约有 30 亿人曾经感染过乙型肝炎病毒，约占世界总人口的一半，主要分布在亚洲和非洲（图 1）。其中 5%~10%的人发展为慢性携带者，而这当中的 20%左右最终将死于与 HBV 相关的严重肝病，15~40%将进展为肝硬化、肝癌或肝衰竭，中国每年因感染乙型肝炎病毒而导致发病的人数达到 50~100 万（图 2），每年约有 30万人死于肝硬化和肝癌，给个人和社会带来沉重的负担。中国是乙型病毒性肝炎的高发区，据 1992 年全国病毒性肝炎血清流行病学调查，全国的平均感染率 10％，2006年第三次全国乙型肝炎血清流行病学调查，中国乙肝的平均感染率为 7.18％，中国累计有 7 亿人曾感染过乙型肝炎病毒，有 1.2 亿人携带乙型肝炎病毒，乙肝病毒感染是慢性肝炎的主要致病因素之一[1, 2]，HBV 感染及肝细胞癌(HCC)的发生在中国已经成为一个严重的公共卫生问题，而且已经成为威胁人类健康的全球性问题。

分子结构图,分子结构,负链

- 12 -图 3 HBV 分子结构乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝病毒科(hepadnaviridae)正类嗜肝病毒属(orthohepadnavirus)，HBV DNA 由不完全的环状双链 DNA 组成，长的为负链，短的为正链，负链约含 3200 碱基（base pair，bp），正链的长度可变，相当于负链的50%~80%，HBV 基因组中包含 4 个开放读码框（open reading frame，ORF），均位于负链，分别是 S 区、C 区、P 区和 X 区（图 3），分别编码外膜蛋白、核壳、聚合酶和 X 蛋白，X 蛋白因开始鉴定时对其基因产物的功能不明而称 X，其中 S 区又分为前 S1、前 S2 和 S 三个编码区，分别编码 PreS1、PreS2 和 HBsAg 蛋白，C 区又可分为前 C 区（precore）和核心区（core），分别编码 HBeAg 和 HBcAg。由双链 DNA 转录为 RNA 是一个需要高度调节的过程。因而病毒基因组不仅含有编码蛋白的结构基因，也有调节元件，作为调节元件的一段 DNA 序列可与某些细胞蛋白或病毒蛋白结合正性或负性调节转录，分散在整个 HBV 基因组中有多个调节

序列,复制过程,肝细胞,启动子

- 14 -（引自 Gamen D,et al.N Engl J Med 2004;350:1118-29）增强子(enhancer)是指能使他连锁的基因转录频率明显增加的 DNA 序列，其功能主要是通过与调节蛋白相互作用刺激特定的一个或一组基因的基础转录活性，常由一个或多个连续或不连续的 DNA 序列元件组成，并与特异的蛋白质相互作用，这些DNA 结合蛋白可由病毒本身编码，也可由宿主细胞编码，HBV 的两个增强子分别为Enh I 和 EnhⅡ。Enh I 在 S 基因和 X 基因之间，大约在 1070-1234nt 前后加减 100 bp的区段，Enh I 定位在 P 基因中，末端与 X 基因启动子重叠，可增强 C、SP I、SPⅡ和 X 启动子的转录，如对下游的 C 启动子比对 X 启动子的增强作用高 60 倍，Enh I

【共引文献】