局部应用胎盘来源间充质干细胞促进小鼠肠皮瘘的愈合

发布时间：2020-10-01 16:18

　　 实验背景及目的:克罗恩病(Crohn’s disease,CD)是一种原因尚未完全阐明的慢性炎症性肉芽肿性疾病。可侵害口腔至肛门的整个消化道,在消化道任何部位均可发病,尤其肠道最多,主要见于回肠末端和邻近结肠。瘘管形成是CD的特征性临床表现,包括内瘘和外瘘。内瘘通常通向体内其他部位,如其他肠段、输尿管、阴道、膀胱、肠系膜、腹膜后等;外瘘是通过腹壁或者肛周皮肤,与外界相通。约25%的CD患者在疾病过程中会发生难治性的瘘管,严重影响其生活质量。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种具有低免疫源性及免疫调节能力的多能干细胞,在炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)中具有非常好的治疗前景。因此,我们通过建立小鼠肠道-皮肤瘘管模型模拟CD患者肠-皮瘘的形成,局部应用MSCs对其进行干预,观察其治疗效果,并进一步研究其可能的作用机制。实验方法:首先我们构建了一种可以通过小动物活体成像技术实时追踪细胞运动及存活的携带萤火虫荧光素酶-绿色荧光蛋白双融合报告基因的MSCs细胞系。然后建立小鼠肠道-皮肤瘘管模型,随机分为磷酸盐缓冲液(phosphate buffer,PBS)对照组、MSCs治疗组,每组8只。肠道-皮肤瘘瘘口局部多点注射移植等体积的PBS或MSCs(1×10~6个细胞)后,在不同的时间点,通过小鼠体重下降百分比、瘘口部位宏观表象、组织病理学技术等检测瘘口组织的再生修复情况;通过生物发光成像技术(bioluminescence imaging,BLI)检测MSCs移植后在体内的存活情况、瘘口部位活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的含量以及血管新生情况;收集瘘口组织进行实时定量PCR检测组织炎症相关因子、血管新生相关因子的表达;同时,为了在体外条件下评价MSCs在血管形成过程中的作用,我们用MSCs培养后的细胞上清液处理人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),观察其对HUVECs细胞的增殖、迁移、成管过程中的影响。实验结果:小鼠肠道-皮肤瘘管模型建立后,经小动物X光钡剂造影显示小鼠瘘管形成。小鼠肠-皮瘘模型形成后,局部注射MSCs或PBS缓冲液后于1,3,5,7天经小动物活体成像显示,MSCs可以稳定聚集于小鼠肠道-皮肤瘘口部位,并在瘘口部位存活约1周;与此同时,MSCs治疗可以降低小鼠体重下降百分比,促进小鼠体重恢复,加快小鼠瘘口部位的愈合速度;实时定量PCR结果显示MSCs治疗可以降低瘘口部位炎症促进因子表达,增加炎症抑制因子的表达,抑制瘘口炎症;并增强瘘口部位的血管新生相关因子的表达。生物发光成像及化学发光成像结果显示MSCs治疗组小鼠瘘口部位ROS含量下降,血管新生能力增强,加快了小鼠瘘口的愈合。此外,在体外条件下,我们证明了MSCs上清液可以显著促进HUVECs细胞的增殖、迁移,及成管。实验结论:在小鼠肠道-皮肤瘘管模型中,局部应用间充质干细胞可以通过减少体重下降百分比,减轻组织炎症,促进损伤部位组织血管新生,加速肠道-皮肤瘘管的愈合。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R574
【部分图文】：

天津医科大学硕士学位论文按照前述方法培养于 75 cm2培养瓶内，接种约 2-3 天后，细胞融合度达 90%以上，按照前述操作步骤将细胞不断消化、计数、传代，直至第 10 代。结果显示：在体外培养过程中，WT-P-MSCs 或 DF-P-MSCs 均具有很强的增殖能力，其增殖曲线成指数型（图 1.2 C）。

图 1.3 P-MSCs 的表型鉴定。.2 P-MSCs 局部移植2.1 肠道-皮肤瘘管模型的构建及验证通过前述方法我们成功建立了小鼠肠道-皮肤瘘管模型（图 2.1 A）。于瘘管成后第 3 天，我们通过小动物 X 线钡剂造影由瘘管外口向瘘管内输注造影剂，证肠道-皮肤瘘管是否形成。结果如图所示：小鼠肠道-皮肤瘘管通畅，钡剂由外可以进入体内肠管，说明小鼠肠道-皮肤瘘管模型构建成功（图 2.1 B）。

天津医科大学硕士学位论文图 1.3 P-MSCs 的表型鉴定。2.2 P-MSCs 局部移植2.2.1 肠道-皮肤瘘管模型的构建及验证通过前述方法我们成功建立了小鼠肠道-皮肤瘘管模型（图 2.1 A）。于瘘管形成后第 3 天，我们通过小动物 X 线钡剂造影由瘘管外口向瘘管内输注造影剂，验证肠道-皮肤瘘管是否形成。结果如图所示：小鼠肠道-皮肤瘘管通畅，钡剂由体外可以进入体内肠管，说明小鼠肠道-皮肤瘘管模型构建成功（图 2.1 B）。

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