Tim-3参与调节NASH进展过程中肝脏巨噬细胞的动态演变

发布时间：2020-10-17 19:22

　　 研究背景与目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成为威胁人类健康的一种严重的慢性肝病,据报导,约25%的NAFLD患者会发展成为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)。目前,对NASH的药物治疗手段有限,因此,探明NASH的发病机制,在疾病的源头阻止疾病进一步进展尤为重要。NASH的一个重要特点就是炎症细胞的浸润,其中巨噬细胞被认为是抵抗肝损伤的第一道屏障。因此,探明肝脏巨噬细胞在NASH发病中的作用及功能演变尤为重要。目前,对NASH进展过程中巨噬细胞表型的动态变化及机制仍不清楚,因此,本研究旨在探究小鼠肝脏巨噬细胞在NASH进展过程中的表型及功能的动态变化,并探讨游离脂肪酸通过T细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3(Tcell Immunoglobulin domain and Mucindomainprotein-3,Tim-3)对巨噬细胞分型的影响,为NASH的早期诊断及治疗提供新的思路。研究方法1、第一部分:动态研究小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型进展过程中肝脏巨噬细胞的募集及分型变化采用MCD饲喂小鼠制备小鼠NASH模型,并于饲喂的第1、2、3、4周分别处死动物,采集小鼠外周血及肝组织,对肝脏进行HE染色以观察小鼠肝脏的冰露改变,同时分离小鼠血清检测肝功能及炎症因子的变化。分离小鼠肝脏单个核细胞,通过流式细胞术检测CD11b+F4/80+及CD206+F4/80+巨噬细胞的动态变化,并通过q-PCR检测肝脏巨噬细胞中Arg-1,FIZZ及iNOS的表达变化。2、脂肪酸引起巨噬细胞分型变化的机制研究采用MCD饲喂小鼠制备小鼠NASH模型,并于饲喂的第1、2、3、4周分别处死动物,分离小鼠肝脏单个核细胞,流式细胞术检测Tim-3+F4/80+巨噬细胞的动态变化。游离脂肪酸(FFA)刺激THP-1、Raw264.7、人外周血单核细胞细胞后,流式检测Tim-3及M1型分子HLA-DR的变化;FFA刺激过表达Tim-3的THP-1细胞后检测HLA-DR的变化;FFA处理M-CSF诱导的M2型巨噬细胞后,检测M2型分子CD206的变化。研究结果1、动态研究小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型进展过程中肝脏巨噬细胞的募集及分型变化(1)在NASH进展过程中,小鼠肝脏F4/80+细胞在肝脏单个核细胞中的比例增加;(2)小鼠NASH进展过程中,肝脏募集外周CD11b+的巨噬细胞增加,并持续维持在高水平;(3)在NASH形成早期,小鼠肝脏M2型巨噬细胞增加,之后随着疾病进展逐渐减少;(4)随着NASH进展,小鼠血清TNF-α水平逐渐升高,而IL-10在疾病早期明显升高,之后随着疾病进展逐渐降低。2、脂肪酸引起巨噬细胞分型变化的机制研究(1)在NASH进展过程中,小鼠肝脏巨噬细胞表面Tim-3升高,之后随着疾病进展逐渐降低;(2)游离脂肪酸能抑制巨噬细胞Tim-3的表达,并促进巨噬细胞向M1型极化;(3)游离脂肪酸对过表达Tim-3的巨噬细胞的活化作用减弱;(4)游离脂肪酸可使以分化为M2型的巨噬细胞向M1型极化。研究结论1、随着NASH疾病进展,小鼠肝脏募集外周单核/巨噬细胞增多并表现出不同的功能状态:在疾病早期M2型巨噬细胞增加,并随着疾病进展逐渐减少;2、游离脂肪酸通过抑制巨噬细胞Tim-3的表达,促进巨噬细胞向M1型极化。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R575.5
【部分图文】：

１．３．９统计分析??实验数据采用ＳＰＳＳ?１７．０?ｆｏｒ?Ｗｉｎｄｏｗｓ分析，数据用Ｍｅａｎ±ＳＤ表示，两组间??数据比较采用Ｔ－ｔｅｓｔ检验，多组间数据比较采用ＡＮＯＶＡ评价组间的差异性，每个??体外实验至少重复３次，Ｐ＜０．０５认为差异具有显著性。??１．４实验结果??１．４．１?ＭＣＤ制备小鼠ＮＡＳＨ模型??ＭＣＤ饲喂后，小鼠较正常饮食组体重减轻（图１）。ＭＣＤ饲喂一周后肝细胞??内即出现脂肪变，肝细胞体积叫正常组增大，胞质内出现脂肪空泡；饲喂２－３周时，??肝细胞内脂肪空泡增多，并出现气球变性，少许炎症细胞浸润；第４周时，肝小??叶内炎症细胞浸润增多，并逐渐出现肝纤维化的表现。（图２）与正常饮食组相比，??模型组小鼠ＡＬＴ／ＡＳＴ均升高，在第２周出现明显升高并维持在较高水平。??Ａ?Ｂ??＾?ＮＣＤ

浙江大学博士学位论文?第一部分动态研究小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型进展过程???中肝脏巨噬细胞的募集及分型变化??变化；图Ｂ：小鼠肝内甘油三醋含量变化??．

图３ＭＣＤ饮食饲喂小鼠肝功能情况。Ａ：?ＡＬＴ变化情况；Ｂ：?ＡＳＴ变化情＊：?Ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０＿０１??１．４．２小鼠肝内巨噬细胞在ＮＡＳＨ进展过程中含量变化??为了了解ＮＡＳＨ进展过程中小鼠肝内巨噬细胞含量的变化，每周分离正常及模型组小鼠肝脏单个核细胞，利用流式细胞术检测小鼠肝脏单个核细胞内Ｆ４／阳性的巨噬细胞的比例。如图４所示：ＭＣＤ饲喂一周后，小鼠肝内巨噬细胞单个核细胞比例（１９．２４±１．８５％）较正常组（８．５９±２．３８％）增多（Ｐ＝０．０３３），并１４??
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本文编号：2845221