促红细胞生成素对大鼠胰腺腺泡细胞和肺组织的保护作用

发布时间：2020-10-22 04:41

【摘要】：【目的】探索原代培养胰腺腺泡细胞方法并鉴定所培养细胞的性质，为急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)体外模型的构建创造条件，通过促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)对胰腺腺泡细胞和肺组织保护作用的研究，为今后EPO治疗AP的临床应用提供理论依据。 【方法】分离提纯胰腺腺泡细胞，将其置于DMEM-F12培养液中培养，24h后电子显微镜下观察胰腺腺泡细胞的超微结构变化，并运用PaA抗体鉴定培养细胞性质。90只Sprague-Dawley(SD)大鼠分为假手术组(sham-operation group, SO)，SAP(Severeacute pancreatitis, SAP)组，EPO1000组，EPO3000组，EPO5000组，每组18只，分别按以下时间24h、48h、72h随机处死6只。逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠(sodiumtaurocholate, STC)（0.1ml/100g)制备SAP大鼠模型。测大鼠肺、胰腺干湿比重及体重系数，人工碘比色法测血清AMS，Elisa试剂盒测IL-1、IL-6和TNF-α，分析3种炎性因子的相互关系；HE染色观察胰腺和肺组织病理变化，免疫组化法检测胰腺组织中EPOR的表达，Elisa法检测EPOR表达水平。 【结果】①新鲜分离的大鼠胰腺腺泡细胞悬浮在培养液中，形态不规则，细胞质与细胞核比例较大。分离纯化后腺泡细胞绝大多数呈圆形或椭圆形，细胞核呈圆形，偏于一侧，细胞间杂质较少。②24h后可见细胞数有所增加，细胞明显聚集，2～3天换液后观察细胞，细胞活性好，细胞数目明显增多，传代良好。③经台盼蓝染色测定细胞活性达96%以上，符合进一步实验要求。④电镜下，大量的酶原颗粒位于细胞顶部的胞质内，细胞内可见发达的粗面内质网，在酶原颗粒聚集的区域可见高尔基复合体。⑤经PaA抗体检测腺泡细胞在免疫荧光镜下呈现大片绿色荧光。⑥SAP组大鼠肺脏干湿比重大于SO组(P0.05)，经EPO治疗后，肺、胰腺水肿减轻；SAP组大鼠体重系数亦大于SO组和EPO组(P0.05)；⑦SAP组与EPO组血清AMS、IL-1、IL-6、TNF-α水平均明显高于SO组，经EPO治疗24h和48h后，测血清AMS明显降低（P0.05），SAP组和EPO组各时间点的血清炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α)含量均高于SO组, SAP组升高显著，48h达到峰值，72h有所回落，经EPO治疗后各指标均有下降，EPO疗效呈时间依赖性，三者之间呈正相关性(r=0.534, p=0.02; r=0.584, p=0.04; r=0.820，p=0.00)，有相互促进表达作用。⑧SO组胰腺和肺组织均无明显病理变化；SAP组大鼠胰腺和肺组织出现不同程度水肿、渗出、炎症细胞浸润，部分组织出现出血、坏死、空泡形成，细胞间结构模糊，甚至连接成片；EPO治疗组胰腺和肺组织病理损伤程度明显改善，病理评分显著低于SAP组（P0.05）。组间比较显示：除EPO3000和EPO5000间无统计学意义外，其他各组间差异均有统计学意义。⑨EPO治疗组、假手术组大鼠胰腺和肺组织中，可见散在的EPOR阳性表达，染色位置位于胞浆；不同剂量EPO治疗组中EPOR在胰腺和肺组织中均呈现大片深染的阳性表达。⑩ELISA法测EPOR表达量示：假手术组、SAP组EPO1000组中EPOR表达量的变化不显著，差异无统计学意义，EPOR表达量随EPO剂量的增加而增加。 【结论】①本实验方法可成功原代培养胰腺腺泡细胞，培养细胞纯度及存活率高，符合体外实验要求；②PaA抗体可成为鉴定胰腺腺泡细胞的一种便捷、可行的方法，其特异性高，可推广应用于鉴定胰腺腺泡细胞；③SAP组大鼠血清中炎症介质IL-1、IL-6、TNF-α水平呈逐渐升高趋势；EPO可有效减轻胰腺和肺组织病理损伤，降低SAP大鼠血清AMS、IL-1、IL-6、TNF-α水平；④ELISA法及免疫组化法检测出胰腺腺泡细胞上EPOR的表达，其表达量随EPO剂量的增加而增加，但与治疗时间无明显相关性，由此推测EPO可与EPOR结合后，激活下游的细胞信号转导通路，从而起到抗炎的作用。
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R576
【图文】：

填满标本表面，暗室内放置 30min，PB分，光学树脂封片后于免疫荧光镜下观大鼠胰腺腺泡细胞微镜下，新鲜分离的大鼠胰腺腺泡细胞不规则形间质细胞及细胞碎片单个胰腺，直径约为红细胞的 4～6 倍，细胞质

图 1 新鲜分离的大鼠胰腺腺泡细胞Fig.1 Freshly isolated acinar cells (o.m分离液分离纯化后的胰腺腺泡细胞细胞分离液分离纯化细胞后可见绝大多质与细胞核比例较大，核圆形，偏于一

图 3 培养 12h 后的胰腺腺泡细胞Fig.3 after 12 h culture (o.m 40×)后的胰腺腺泡细胞数有所增加，细胞聚集明显，可见多数细胞胞活性好，细胞数目明显增多，传代良好
【参考文献】

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1 刘学进;陈垦;龙友明;王晖;谢文瑞;;不同浓度的脂多糖刺激AR42J细胞对NF-κB及ICAM-1表达的影响[J];广东药学院学报;2007年01期

2 黄莛庭;;急性胰腺炎细胞内早期事件的再认识[J];中华肝胆外科杂志;2006年02期

本文编号：2851106