HLA-G5参与UC-MSCs移植治疗大鼠急性肝衰竭中的免疫调节作用

发布时间：2020-10-22 21:28

　　 第一部分:脐带间充质干细胞分离、培养以及HLA-G5表达的初步研究 背景间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新和多向分化的潜能,并具有低免疫原性和免疫调节作用,能抑制同种异体免疫排斥反应,是一种较为理想的组织工程种子细胞,但具体的免疫调节机制尚未完全阐明。研究表明,MSCs可以低水平表达人白细胞抗原HLA-I类分子而不表达HLA-Ⅱ类分子、CD80、CD86、CD40或CD40L共刺激分子,因此MSC不能触发T细胞激活。HLA-G5是一种非经典的HLA-I类分子,具有多种免疫抑制功能,如NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞溶解,同种异体基因T细胞增殖,以及树突细胞成熟。鉴于HLA-G5和MSCs都具有免疫调节性质,本实验从人脐带中分离获取MSCs,观察脐带间充质干细胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)是否表达HLA-G5,并研究其在MSCs介导免疫调节功能中的作用。 目的从脐带中分离、培养间充质干细胞并予以鉴定,并研究HLA-G5在人脐带间充质干细胞中表达及其对T细胞体外的负性协同作用。 方法采用双酶消化法分离脐带组织,进行贴壁分离和传代培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,用流式细胞仪检测细胞表面标志的表达,并进行成脂、成骨诱导鉴定;采用蛋白质印记法(western blot)检测UC-MSCs中HLA-G5蛋白水平的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测重组人白细胞介素10(rhIL-10)干预后UC-MSCs培养上清中HLA-G5的含量变化;3H-TdR掺入法检测UC-MSCs对PHA刺激后的T细胞增殖的影响以及HLA-G5单克隆抗体部分阻断UC-MSCs抑制T细胞增殖的影响,ELISA法检测培养基上清液中细胞因子水平,以及HLA-G5单克隆抗体阻断作用后细胞因子水平的变化。 结果(1)UC-MSCs贴壁生长,呈成纤维细胞形态,表达CD73、CD90、CD105,但不表达CD34、CD45、HLA-DR分子,在体外能向成脂肪细胞、成骨细胞方向诱导分化;(2)UC-MSCs表达37kDa的HLA-G5蛋白,且随着细胞传代,HLA-G5表达量下降;(3)rhIL-10干预后UC-MSCs培养基上清液中HLA-G5含量明显增高(P0.05),并存在剂量依赖性;(4)UC-MSCs可抑制活化T细胞体外增殖,并调节IL-4、IFN-γ的分泌,使用HLA-G5mAb阻断后,抑制效果减弱。 结论采用双酶消化法可以成功分离培养出UC-MSCs;UC-MSCs在体外具有抑制T细胞活化和增殖的作用,其表达的HLA-G5因子具有重要的免疫调节作用。 第二部分:脐带间充质干细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的疗效观察 背景急性肝衰竭具有进展快,并发症多,治疗难度大,死亡率高,预后极差的特点,是当前肝脏疾病治疗的热点与难点,发病机制复杂,目前认为是由于机体免疫反应过强,短期内过强T细胞毒反应,迅速破坏大量肝细胞,引起大块状肝脏坏死。肝移植是治疗这种疾病的有效方法,但面临许多问题,如:供体缺乏、手术创伤大、排异反应、费用昂贵等,为此,迫切需要寻找治疗肝衰竭新方法。UC-MSCs可以在体内增殖、分化为肝细胞或肝样细胞,替代受损的肝细胞,促进肝功能恢复。目前,对于MSCs治疗肝衰竭作用机制的研究主要集中在MSCs的分化潜能方面,然而研究发现,MSCs在体外诱导分化为肝细胞需要7-14天,体内分化也需要4-5天,而MSCs在移植的早期未分化为肝细胞或肝样细胞时即显示出显著的疗效,用干细胞分化机制不足以解释MSCs移植的这种早期应答。那么MSCs对大鼠急性肝衰竭(Acute Liver Failure,ALF)早期作用机制如何?是本部分的研究重点。 目的探讨UC-MSCs移植治疗对急性肝衰竭大鼠的肝功能、生存率和相关炎症细胞因子的影响,以及HLA-G5参与UC-MSCs免疫调节功能在治疗中的重要性。 方法采用D-GAL联合LPS腹腔注射的方法制作大鼠肝衰竭模型;按第一部分的方法从脐带中分离培养出rhIL-10干预培养的UC-MSCs(HLA-G5高表达)及正常UC-MSCs,并利用CFSE进行标记;将两组细胞经尾静脉移植治疗大鼠肝功能衰竭模型各16只,并与模型对照组(n=16)进行比较,观察三组大鼠一般状况、生存率等情况,动态检测肝功能及肝脏病理变化,荧光显微镜下观察MSCs归巢至肝脏的情况,以及ELISA检测血浆中IL-4、IFN-γ含量变化。 结果经CFSE标记的UC-MSCs染色后可见较强的绿色荧光,细胞标记率接近99%。造模后大鼠逐渐进入肝衰竭状态,表现为拒食,活动明显减少,萎靡、嗜睡或逐渐发展为昏迷状态,对外界刺激反应较迟钝,全身毛蓬松无光泽,尿失禁,尿色深黄;生化检查发现肝功能严重损害,组织学检查显示肝细胞大片坏死、大量炎性细胞浸润。从移植术后3d开始,实验组和移植对照组存活大鼠一般情况明显好于模型对照组;肝功能及肝脏组织学改善,实验组肝功能明显好于移植对照组。与正常大鼠比较,模型组血浆IFN-γ水平明显升高(P0.05),而IL-4水平无明显差异(P0.05),UC-MSCs治疗后,血浆IFN-γ水平明显降低,而IL-4水平明显升高,高表达HLA-G5的UC-MSCs治疗后IL-4变化更明显(P0.05)。 结论UC-MSCs经尾静脉移植治疗大鼠肝衰竭模型,能够促进大鼠肝功能修复,减轻肝脏组织的炎症反应,对急性肝功能衰竭具有明显治疗作用。UC-MSCs可利用免疫调节作用使促炎因子与抗炎因子达到新的平衡,且HLA-G5参与此过程,这可能是UC-MSCs移植治疗ALF的作用机制之一。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R575.3
【部分图文】：

经 2 次换液后，混杂细胞基本脱落，留下形态均一的梭形细胞，10d 左右，梭形细胞增殖加快，至 15-20d，原代细胞可铺满瓶底达 80%以上，细胞间界限不清，细胞呈长梭状，最终汇合成均质的长梭形细胞单层，呈明显的漩涡状、辐射状排列 (见图1.1)。经胰酶消化，传代细胞在 12h 内完全贴壁、伸展，呈长梭形，周期一般为 5～10d。多次传代后，细胞仍呈均质的梭形细胞群，漩涡状方式生长，并保持很强的增殖活性。4.2 UC-MSCs 的体外生长曲线UC-MSCs 原代细胞生长周期约为 20d，第 12d 为生长高峰期。细胞经过传代后，前 3d 细胞生长较慢，为潜伏期。第 4 天后进入细胞快速增殖期，1 周以后进入平台期。群体倍增时间约 24 h。1、3、5 代细胞生长曲线基本相同（见图 1.2）。4.3 UC-MSCs 免疫表型的检测取 3 代以后的 UC-MSCs 进行流式分析

脐带间充质干细胞体外培养生长曲线

UC-MSCs成脂肪诱导鉴定，油红O染色（×100）
【参考文献】

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1 叶一农;高志良;;乙型肝炎肝衰竭发生机制中的三重打击[J];传染病信息;2009年05期

2 黄小平;秦爱兰;赵卫峰;江敏华;罗二平;吴绍宏;甘建和;;慢性肝功能衰竭时骨髓间充质干细胞胞膜CXCR4的表达及影响因素[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年40期

3 陈军;刘玉侠;姜文华;韩光;姜文平;;体外诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年49期

4 陈瑜;毛卫林;俞炯;吴炜;陈月美;李兰娟;;肝衰竭患者外周血CD_4~+ CD_(25)~+调节性T淋巴细胞水平变化与疗效的相关性研究[J];中华检验医学杂志;2007年08期

本文编号：2852119