HepG2.2.15细胞脂肪变性对HBV基因表达及SOCS-3和SREBP-1c通路的影响

发布时间：2020-11-07 19:43

　　研究背景慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染引起的，已成为一个严重的全球性公共卫生问题，全世界共有20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者。在慢性HBV感染者中，约15％～25％最终死于与HBV感染相关的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC），其中慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B，CHB）、代偿期和失代偿期肝硬化患者的5年病死率分别为0%～2%、14%～20%和70%～86%。多年来，我国慢性乙肝的发病数和发病率一直高居前列，严重危害人民的健康，2006年卫生部公布的全国乙型肝炎病毒感染流行病学调查结果显示，1～59岁人群乙肝表面抗原携带率为7.18%。非酒精性脂肪肝病（Nonaleoholie Fatty Liver Disease，NAFLD）是除外过量饮酒和其他明确损肝因素所致的，以弥漫性大泡性脂肪肝变性为特征的获得性代谢应激性肝损伤，NAFLD是一种与胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，疾病谱包括单纯性脂肪肝（Non-alcoholic Fatty Liver，NAFL），脂肪性肝炎（Non-alcoholic Steatohepatitis，NASH）及NASH相关肝硬化。流行病学调查表明，NAFLD已呈全球化流行趋势，约20～30%甚至更高的的人患有NAFLD。我国NAFLD在过去的10年里增加了近一倍。NAFLD可以直接引起肝病发生发展，甚至引起急性肝功能衰竭（Acute Liver Failure，ALF）。临床研究发现，许多CHB患者合并有NAFLD，这种现象越来越受到众多的学者的重视，综合一些大规模的流行病学调查结果，NAFLD在CHB人群中的发生率大约在11～15%之间。研究证实，高达62％丙型肝炎患者合并有NAFLD，IR在HCV（Hepatitis C virus）感染者体内广泛存在。HCV基因型1型和4型可通过IR导致肝脂肪变性，基因型3型则能直接引起肝细胞的脂肪变性，这些代谢因素的影响，加速肝纤维化的形成以及肝癌发生的风险。那么，HBV是否也会同HCV一样导致IR？肝细胞脂肪变对肝内HBV的复制、抗原的合成和表达有无影响？HBV在脂肪肝的发生过程中起协同还是拮抗作用？目前这些问题已引起了学术界的高度关注，也是本研究的主要内容。本研究共分为以下四部分：第一部分HepG2.2.15细胞脂肪变性模型的建立。第二部分HepG2.2.15细胞脂肪变性对HBVDNA和蛋白表达的影响研究。第三部分HBV对脂肪变性HepG2.2.15细胞SOCS-3及SREBP-1c通路的影响研究。第四部分TGFβ1对HepG2.2.15细胞脂肪变性的影响研究。第一部分HepG2.2.15细胞脂肪变性模型的建立实验一HepG2及HepG2.2.15细胞的培养与观察目的建立HepG2/HepG2.2.15细胞冻存、复苏和传代的条件，了解细胞增殖特性及HBV的复制和表达能力。方法采用无菌培养方法，细胞培养液中添加G418，倒置显微镜观察细胞生长状况，台盼蓝细胞的计数及活力鉴定，荧光实时定量PCR方法检测细胞上清液中的HBV DNA，时间分辨荧光分析仪检测HBsAg和HBeAg。结果含10% FBS培养基可维持细胞的指数生长，含70% FBS的冻存液可保证细胞复苏成活率达90%，HepG2.2.15细胞HBVDNA、HBsAg及HBeAg量随培养时间延长而稳步增长。结论HepG2/HepG2.2.15生长快速，对培养基和冻存液血清浓度要求较高。定期向HepG2.2.15细胞培养液中添加G418可保证HepG2.2.15内HBV的稳定复制和蛋白表达。实验二HepG2及HepG2.2.15细胞脂肪变性模型的构建目的建立HepG2/HepG2.2.15细胞脂肪变性的实验条件。方法选择油酸（OA）作为脂肪诱导剂，设定0.1～0.4mM浓度梯度对HepG2/HepG2.2.15细胞进行脂变诱导。细胞分为对照组、二甲基亚砜（DMSO，油酸溶剂）组和不同浓度OA组。MTT法检测细胞相对活性并制作细胞生长曲线，油红O-苏木素染色观察细胞内脂滴情况并计算脂变率。结果生长曲线结果显示，OA浓度≤0.2mM时细胞增殖活力不受影响，OA浓度＞0.2mM后随OA浓度增高细胞的增殖能力逐渐下降，0.2%DMSO不影响细胞的增殖。油红O染色结果显示，在0.2mM浓度OA作用下24h时细胞内开始出现橘红色小脂滴，随作用时间的延长脂滴逐渐增多增大，72h时形成明显脂变。HepG2.2.15细胞在24h、48h时的平均脂变率均低于HepG2细胞（P=0.028，0.022），72h时无明显差异（P=0.372）。结论0.2mM浓度的OA作用72h可使HepG2/HepG2.2.15细胞在不影响细胞增殖能力的情况下形成明显的脂肪变性，HepG2.2.15细胞脂变程度在24h、48h时低于HepG2细胞，72h时无明显差异。实验三HepG2及HepG2.2.15细胞脂肪变性对TG及ALT的影响目的探讨HepG2/HepG2.2.15细胞脂肪变性对TG及ALT的影响。方法细胞分为HepG2细胞对照组（C1组），HepG2.2.15细胞对照组（C2组），HepG2细胞脂变组（F1组），HepG2.2.15细胞脂变组（F2组），按照第一部分实验二方法对HepG2/HepG2.2.15细胞用不同浓度OA进行脂变诱导，采用反复冻融法裂解细胞，全自动生化分析仪检测细胞内的TG及细胞上清液中的ALT。结果 1、TG：配对t检验，F1大于C1组，F2组大于C2组。独立样本t检验，F1组大于F2组，24h、48、72h均有统计学意义（P均＜0.05）。 2、ALT：配对t检验，F1组大于C1组，F2组大于C2组，48、72h有统计学意义。独立样本t检验，F1组小于F2组，24h、48、72h均有统计学意义（P均＜0.05）。结论：HBV可抑制脂变细胞TG的合成和增加脂变中细胞膜损伤。第二部分HepG2.2.15细胞脂肪变性对HBVDNA和蛋白表达的影响实验一、HepG2.2.15细胞脂肪变性对HBV DNA的影响目的探讨肝细胞脂肪变性对细胞内HBV复制的影响。方法细胞分为对照组（C2组）和脂变组（F2组），按照第一部分实验二建立的方法对HepG2.2.15细胞进行脂变诱导。采用荧光实时定量PCR方法检测细胞上清液中的HBVDNA。结果对照组上清液中HBV DNA（对数值）随培养时间的延长稳定上升，呈一条直线，脂变组HBV DNA呈现曲折上升方式。配对t检验，结果显示：24h、48h、72h时F2组HBV DNA与C2组相比，无统计学意义（t=-2.93，P=0.784；t=0.065，P=0.951；t=1.551，P=0.182）。结论脂肪变性对HepG2.2.15细胞内病毒复制能力无显著影响，但会造成HBV DNA的复制的轻微波动。实验二、脂肪变性对HepG2.2.15细胞HBV蛋白表达的影响目的探讨肝细胞脂肪变性对细胞内HBV标记物表达的影响。方法细胞分为对照组（C2组）和脂变组（F2组），按照第一部分实验二建立的方法对HepG2.2.15细胞进行脂变诱导。采用时间分辨荧光分析仪检测细胞上清HBsAg、HBeAg。结果 1、HBsAg的表达：配对t检验结果显示，F2与C2组24h相比，t=32.985，P＜0.001，48h相比t=5.843，P=0.002，72h相比t=10.517，P＜0.001，均有统计学意义，提示HepG2.2.15脂变组HBsAg的表达较对照组明显下降。 2、HBeAg表达：配对t检验结果显示，F2与C2组24h相比t=0.283，P=0.789，48h相比t=0.523，P=0.623，72h相比t=-0.542，P=0.611，均无统计学意义。提示HepG2.2.15脂变组与对照组之间24h、48h、72h时HBeAg表达均无明显变化。结论HepG2.2.15细胞脂肪变性对其胞内HBV的HBsAg、HBeAg表达影响不同。可显著抑制HBsAg的合成表达，而对HBeAg无影响。提示HBsAg下降可能与脂变导致细胞膜结构有关。第三部分HBV对细胞脂肪变性 HepG2.2.15细胞SOCS-3及SREBP-1c通路的影响研究目的探讨HepG2/HepG2.2.15细胞脂肪变性对SOCS-3、SREBP-1c通路的影响方法细胞分为HepG2对照组（C1组）、HepG2.2.15对照组（C2组）、HepG2脂变组（F1组）、HepG2.2.15脂变组（F2组），按照第一部分实验二建立的方法对HepG2/HepG2.2.15细胞进行脂变诱导，采用免疫组化法观察SOCS-3及SREBP-1蛋白在细胞内的表达变化，采用实时定量PCR法检测SOCS-3及SREBP-1mRNA的相对表达情况。结果 1、免疫组化结果显示，随脂变作用时间的延长HepG2/HepG2.2.15细胞内SOCS-3染色的逐渐变淡，SREBP-1c染色的逐渐加深； 2、SOCS-3 mRNA：C2组水平远远低于C1组（P＜0.001），F1组较C1明显降低，有统计学意义（P=0.003），F2组较C2组相比也出现降低，但无统计学意义（P=0.173）。细胞*脂变有交互作用（F=25.547，P＜0.001）； 3、SREBP-1c mRNA：C2组表达明显高于C1组（P=0.013），F1组较C1组，F2组较C2组均出现的表达上调。但F2组与C2组比较有统计学差异（P=0.002），F1组与C1组比较无统计学意义（P=1.000）。提示细胞*脂变有交互作用（F=5.04，P＜0.03）。结论 1、SOCS-3：HBV基因的存在，可以抑制SOCS-3 mRNA的表达。两组细胞脂变后SOCS-3蛋白和mRNA的表达均出现下调。HepG2细胞的下调程度高于HepG2.2.15细胞。SOCS-3 mRNA的影响随细胞不同而不同； 2、SREBP-1c：两组细胞脂变后SREBP-1c的表达均表现为上调，但HepG2.2.15细胞的上调程度高于HepG2细胞。提示脂变对HepG2/HepG2.2.15细胞SREBP-1c mRNA的影响不同。HBV基因的存在可以促进SREBP-1c mRNA的表达上调。第四部分TGFβ1对HepG2.2.15细胞脂肪变性的影响研究目的 1、探讨TGFβ1对脂变HepG2.2.15细胞HBV复制及蛋白表达的影响； 2、探讨HepG2/HepG2.2.15脂变过程中的TGFβ1与SOCS-3 mRNA、SREBP-1c mRNA的关系。方法细胞分为HepG2/HepG2.2.15细胞对照组（C1/C2组）和脂变组（F1/F2组），并在这两组细胞体系内加入5ng/ml TGFβ1干预，形成TGFβ1作用组（T1/T2）和脂变+TGFβ1组（TF1/TF2），采用时间分辨荧光分析仪检测HBsAg、HBeAg，荧光实时定量PCR法检测HBV DNA、SOCS-3 mRNA及SREBP-1c mRNA。结果 1、HBVDNA T2组与C2组比较P=0.056，TF2与F2组比较P=0.178，均无统计学意义。脂变* TGFβ1无交互作用（F=10.026，P= 0.872）。 2、HBsAg T2组低于C2组，无统计学差异（P=0.961），TF2低于F2组，有统计学差异（P＜0.001）。脂变* TGFβ1有交互作用（F=15.49，P= 0.001）。 3、HBeAg T2组较C2组、TF2较F2组比较均出现降低，均有统计学差异（P=0.004，P=0.034）。脂变* TGFβ无交互作用（F=0.265，P=0.813）。 4、SOCS-3 mRNA T1组较C1组、TF1与F1组、T2组与C2组、TF2组F2组相比均发生下调（分别为P=0.050，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）,TF2与TF1相比，P＜0.001。脂变* TGFβ1有交互作用（F=1.872，P=0.184），细胞* TGFβ1无交互作用（F=12.628，P=0.001)。 5、SREBP-1c mRNA T1组较C1组、TF1与F1组、T2组与C2组、TF2组F2组相比均发生上调（P均≤0.001），TF2与TF1相比，P＜0.001。脂变* TGFβ1、细胞* TGFβ1无交互作用（F=7.655，P=0.009；F=9.70，P=0.003)。结论 1、TGFβ1不影响HepG2.2.15细胞中HBV复制。 2、TGFβ1可抑制HBsAg的表达，抑制能力受脂变因素的影响，脂变组的强于非脂变组。 3、TGFβ1可抑制HBeAg的表达，抑制能力不受脂变因素的影响。 4、TGFβ1可抑制SOCS-3 mRNA的表达，这种抑制受脂变因素的影响，而与病毒因素无关。 5、TGFβ1可上调SREBP-1c mRNA的表达，这种上调与脂变因素及病毒因素无关。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：

曲线,荧光,条件,曲线

解完成后的标本保存在 - 2 0 ℃，待检。解标本 15 00 0 r p m 离心 5m i n，取上清 4 μ l 做 P C R 反应。 R 反应体系 HB V P C R 反应液（含引物、探针、 Bu f f e r 、 dN T P s ） 2+ U N G 酶 1 μl ，加入标本 4μ l ，同时设临界对照，阳性对照，阴性对照 R 反应条件保温 42 ℃ 5 m i n 后，9 4℃ 5 秒， 6 0℃ 4 0 秒，循环 40 次保温。验结果计算将 CT＜ 16 强阳性样品，选择 3～ 1 5 个循环的平均荧光信分析 CT，以刚好高于阴性对照品的扩增曲线最高点，调整阈值，荧光检结果e p G2 . 2 . 15 细胞 HB V D NA 检测的实时荧光曲线（图 22 ，图 23 ）

HepG2.2.15细胞脂肪变性对HBV基因表达及SOCS-3和SREBP-1c通路的影响