PPARα基因V227A变异在肝细胞中的生物学作用及其机制研究

发布时间：2020-11-11 13:41

　　 背景与目的： 过氧化物酶体增殖物激活受体属于核受体超家族的成员,在非酒精性脂肪性肝病的发病机制中发挥了重要的作用。我们前期研究发现：PPARαV227A基因型分布在非酒精性脂肪性肝病和健康人群中存在差异,且PPARα基因227A携带者(突变型)体重、体重指数、臀围、腰围、腰臀比、体脂含量、腹壁脂肪厚度明显低于非227A携带者(野生型),因此推测PPARα基因227A携带者(突变型)对肥胖的发病可能是一保护性因素。为进一步探索PPARα基因V227A变异的生物学功能,本研究拟构建PPARαV227A野生型和突变型的真核表达载体,并转染L02肝细胞株,建立稳定表达PPARα-EGFP融合蛋白的细胞模型；探讨PPARαV227A变异在肝细胞中的生物学作用及其相关机制。 方法： 设计带有突变碱基的引物,通过融合PCR引入突变碱基,获取PPARαV227和227A的全长基因,再将野生型和突变型的PPARα基因插入真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP-N1-PPARαV227A重组质粒。经测序验证、确定所扩增的DNA序列为PPARα基因。以脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N1-PPARαV227、pEGFP-N1-PPARα227A和空质粒pEGFP-N1分别转染L02肝细胞株,经G418筛选出阳性克隆,用荧光倒置显微镜、Western blOt证实PPARα-EGFP融合蛋白在L02肝细胞中的表达。并将L02肝细胞分成四组：pEGFP-N1-PPARαV227组(野生组)、pEGFP-N1-PPARα227A组(突变组)pEGFP-N1组(空载体组)和对照组；每组再分为PPARα激动剂WY14643干预组和WY14643不干预组,分别采用MTT技术检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞的凋亡,并用Western blOt检测PPARα作用相关通路蛋白及信号分子的表达变化。 结果： (1)成功构建了重组真核表达载体pEGFP-N1-PPARαV227(野生型)和pEGFP-N1-PPARα227A(突变型)； (2)获得了稳定表达PPARαV227-EGFP(野生型)和PPARα227A-EGFP(突变型)融合蛋白的L02细胞株； (3) MTT结果显示：野生组细胞生长较为缓慢,与突变组细胞相比,野生组细胞存活率明显降低(P0.01)。 (4)流式细胞术Annexin V与PI双染色结果显示：野生组细胞凋亡率较高,与突变组细胞相比,野生组细胞凋亡率明显升高(P0.01)。 (5) Western blot结果显示：野生组和突变组肝细胞PPARα、RXRα蛋白的表达无明显差异；PPARα激动剂WY14643可诱导PPARα、RXRα蛋白的表达； (6)突变组肝细胞p44/42MAPK (Thr202/Tyr204)磷酸化蛋白的表达水平明显高于野生组；NF-KB-p65 (Ser536)磷酸化蛋白的表达水平低于野生组。 结论： (1)构建了重组真核表达载体pEGFP-N1-PPARαV227(野生型)和pEGFP-N1-PPARα227A (突变型)； (2)获得了稳定表达PPARαV227-EGFP (野生型)和PPARα227A-EGFP(突变型)融合蛋白的L02细胞株； (3) PPARα227A (突变型)细胞存活率高于PPARαV227 (野生型),而凋亡率低于PPARαV227(野生型)； (4) PPARα227A(突变型)可能较PPARαV227 (野生型)有更高的活性,并可能通过增加P44/42MAPK (Thr202/Tyr204)磷酸化蛋白的表达及抑制NF-κB-p65 (Ser536)磷酸化蛋白的表达而影响L02细胞的增殖与凋亡。 该研究结果为PPARαV227A变异在肝细胞中的生物学作用提供了重要的参考价值,但是PPARαV227A野生型和突变型在细胞或机体内具体如何发挥作用仍不明确,有待于在今后的研究工作中做深入的探索。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2011
【中图分类】：R575.5
【文章目录】：
致谢
序言
摘要
ABSTRACT
缩略语表
插图和附表清单
目次
1 绪论
    1.1 研究背景
    1.2 研究内容
2 pEGFP-N1-PPARα V227A真核表达载体的构建
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
    2.3 结果
    2.4 讨论
    小结
3 pEGFP-N1-PPARα V227A真核表达载体转染L02胞
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
    3.3 结果
    3.4 讨论
    小结
4 PPARα基因V227A变异对肝细胞增殖与凋亡的影响
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
    4.3 结果
    4.4 讨论
    小结
5 PPARα基因V227A变异影响肝细胞增殖与凋亡的机制研究
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
    5.3 结果
    5.4 讨论
    小结
6 结论
参考文献
综述
    参考文献
作者简历及在学期间主持课题和发表论文

【参考文献】

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1 ;中国成人血脂异常防治指南[J];中华心血管病杂志;2007年05期

2 Astrid E van der Velde;;Reverse cholesterol transport: From classical view to new insights[J];World Journal of Gastroenterology;2010年47期

本文编号：2879252