研究目的IL-37是IL-1家族的新成员,在2000年首次被发现。与IL-1家族其他成员的促炎作用不同,IL-37发挥抑炎的作用。IL-37的编码基因位于人2号染色体长臂IL-1家族的基因簇区内,有6个外显子,其中外显子4、5、6编码12个β螺旋,组成IL-1家族特有的β三叶草结构,是IL-37发挥生物学功能所必需的。根据组成的外显子不同,IL-37分为a、b、c、d、e五种亚型,其中IL-37b由外显子1、2、4、5、6组成,是最长且具有功能的亚型;IL-37d由外显子1、4、5、6组成,仅比IL-37b少了2号外显子。目前的研究主要集中在IL-37b,对IL-37d的研究尚少。我们实验室利用自己制备的IL-37d转基因小鼠,在国际上首先证明IL-37d是有功能的亚型,IL-37d同IL-37b 一样具有抗炎的作用,但其作用的分子通路不完全相同,具有独特性。然而,IL-37d的其他功能和具体的作用机制尚不清楚。有报道通过蛋白芯片检测发现过表达IL-37b可以使雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平降低,提示IL-37具有抑制mTOR活性的作用,但IL-37b对mTOR的具体作用机制和功能意义尚不清楚。mTOR属于PI3K相关蛋白激酶(PIKK)家族,是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,mTOR作为催化亚基以两种不同的复合体的形式存在—mTORC1和mTORC2,其中mTORC1的作用更加广泛并受到广泛关注。由于mTOR信号通路能感知能量、营养、压力和生长因子等信号,在细胞的生长和代谢等多个过程中发挥重要作用,提示IL-37除了抑炎作用外,在细胞生长和代谢中也发挥作用。那么,IL-37d是否具有调控mTORC1信号通路的作用?其调控机制如何?在细胞代谢(特别是脂质代谢)中的作用如何?都是值得探索的科学问题。本论文的研究目的包括以下三个方面:1.以mTORC1为切入点,确定IL-37d对mTOR信号通路的调控作用;2.探索IL-37d调控mTORC1信号通路的具体分子机制;3.利用IL-37d转基因小鼠构建肝脏脂质积累模型,在体内研究IL-37d对mTORC1信号通路的调控及对肝脏脂质积累的影响。进一步揭示IL-37的功能和机制并为将来IL-37的临床应用提供新的实验依据。研究方法一、IL-37d抑制mTORC1信号通路1.用IL-37d或对照慢病毒感染A549细胞,通过流式细胞术的方法检测细胞大小。2.用IL-37d或对照慢病毒感染A549细胞,通过流式细胞术和Western-blot的方法在基础状态、饥饿状态、饥饿再活化状态下检测mTORC1信号通路下游分子S6的磷酸化情况。3.用IL-37d或对照慢病毒感染A549细胞,通过不同的饥饿方式再活化后,用Western-blot的方法检测p-S6的表达情况,分别是无FBS培养基、无FBS无谷氨酰胺培养基、HBSS饥饿,然后用含10%FBS的培养基活化。4.在HepG2细胞中沉默IL-37,通过免疫荧光的方法检测p-S6的表达情况。5.在HepG2细胞中沉默IL-37,通过Western-blot的方法在基础状态、饥饿状态、饥饿再活化状态下检测mTORC1信号通路下游分子S6、4eBP1的磷酸化情况。二、IL-37d调控mTORC1信号通路的分子机制1.通过免疫共沉淀的方法探究IL-37d与Rheb是否结合。2.通过免疫荧光的方法验证IL-37d与Rheb是否有共定位现象。3.用IL-37d或对照慢病毒感染A549细胞,通过免疫荧光的方法检测GTP形式的Rheb的表达。4.在HEK-293T细胞中分别过表达不同浓度的IL-37d质粒,通过免疫共沉淀的方法检测外源性Rheb与内源性mTOR的结合。5.在基础状态,共同过表达IL-37d和Rheb两种质粒,通过流式细胞术和Western-blot的方法检测p-S6的表达情况。6.共转染IL-37d和活性Rheb两种质粒,无FBS无精氨酸无亮氨酸的培养基饥饿2小时,通过流式细胞术和Western-blot的方法检测p-S6的表达情况。7.共转染IL-37d和活性Rheb两种质粒,EBSS饥饿2小时,通过流式细胞术的方法检测p-S6的表达情况。三、IL-37d抑制mTORC1信号通路介导的肝脏脂质积累(一)IL-37d抑制高脂饮食诱导的mTORC1信号通路的活化及肝脏脂质积累高脂诱导的肥胖模型,选择6～8周的雄性IL-37d转基因和WT小鼠进行高脂饮食(60%脂肪),18周后对小鼠解剖。1.统计小鼠体重和肝重。2.取小鼠肝脏组织切片,进行HE染色观察组织细胞形态。3.取小鼠肝脏组织切片,进行免疫组化染色,检测p-S6的表达。4.提取小鼠肝脏组织蛋白,Western-blot检测p-S6的表达。5.取小鼠肝脏组织匀浆,检测小鼠肝脏中的甘油三酯(TG)含量、总胆固醇(TC)含量、游离脂肪酸(FFA)含量。(二)IL-37d抑制禁食16小时诱导的mTORC1信号通路的活化及肝脏短期脂质积累禁食16小时模型,选择6～8周的雄性IL-37d转基因和WT小鼠进行禁食,16个小时后立即对小鼠进行解剖。1.统计小鼠体重和肝重。2.取小鼠肝脏组织切片,进行HE染色观察组织细胞形态.3.取小鼠肝脏组织切片,进行免疫组化染色,检测p-S6的表达。4.提取小鼠肝脏组织蛋白,Western-blot检测p-S6的表达。。5.取小鼠肝脏组织匀浆,检测小鼠肝脏中的甘油三酯(TG)含量、总胆固醇(TC)含量、游离脂肪酸(FFA)含量。结果一、IL-37d抑制mTORC1信号通路(一)IL-37d抑制细胞大小已知mTORC1信号通路控制细胞生长和细胞大小,为了探索IL-37d对mTORC1信号通路的影响,我们首先检测了过表达IL-37d对细胞大小的影响。在A549细胞中,分别感染IL-37d和对照慢病毒,通过流式细胞术分别检测了基础状态、饥饿状态、饥饿再活化状态细胞大小的改变,发现在基础状态和饥饿再活化状态,感染了 IL-37d慢病毒的这一组较NC组细胞大小减小,在饥饿再活化状态下更为明显,证明IL-37d抑制细胞大小并提示IL-37d可能抑制mTORC1信号通路的活化。(二)过表达IL-37d抑制mTORC1信号通路为了弄清IL-37d对mTORC1信号通路的抑制作用,我们利用过表达体系,采用流式细胞术和Western-blot的方法检测了 IL-37d的过表达对mTORC1下游效应分子S6的磷酸化影响。流式细胞术的结果显示感染IL-37d慢病毒的细胞在基础状态和饥饿再活化状态,mTORC1信号通路下游分子S6的磷酸化明显受到抑制,在饥饿再活化状态S6的磷酸化被抑制的现象更加明显。通过Western-blot的方法检测得到同样的结果。进一步我们比较了三种不同的饥饿方式(无FBS的F12K培养基、无FBS无谷氨酰胺的F12K培养基和HBSS饥饿)再活化(含10%FBS的F12K培养基活化)后IL-37d对mTORC1信号通路的作用,结果发现IL-37d均可以抑制p-S6的表达,进而确定过表达IL-37d对mTORC1信号通路的抑制作用。(三)沉默IL-37上调mTORC1信号通路为了进一步确定IL-37d对mTORC1信号通路活化的抑制效应,我们在HepG2细胞中沉默IL-37表达,然后采用Western-blot的和免疫荧光的方法检测mTORC1通路活性的变化,结果显示沉默IL-37可促进mTORC1信号通路的活化,从另一个方面证明内源性IL-37对mTORC1信号通路的抑制作用。二、IL-37d调控mTORC1信号通路的分子机制(一)IL-37d与Rheb结合已知Ras相关GTP酶(Rheb)是激活mTORC1的关键分子;我们前期研究发现IL-37b可结合Ras家族的另一个成员Racl并抑制其活性,故我们提出假说:IL-37可能通过调控Rheb进而影响mTORC1活性。为了验证我们的假说,采用免疫荧光和免疫共沉淀的方法探究IL-37d和Rheb的关系,免疫荧光的结果显示IL-37d与Rheb在细胞浆内有明显的共定位现象;免疫共沉淀实验进一步证明IL-37d可以与Rheb结合。提示IL-37d可通过与Rheb结合进而调控mTORC1信号通路。(二)IL-37d抑制Rheb的活性为了研究IL-37d与Rheb结合后是否影响Rheb的活性,我们采用免疫荧光的方法检测了过表达IL-37d对Rheb活性形式GTP-Rheb的表达水平的影响,结果显示感染了IL-37d慢病毒后,GTP-Rheb的表达较弱,说明IL-37d可以抑制Rheb的活性。(三)IL-37d不能竞争性抑制Rheb和mTOR的结合为了弄清IL-37d结合后是否可竞争性抑制Rheb与mTOR的结合,我们分别过表达不同浓度的IL-37d,采用免疫共沉淀的方法,分析了IL-37d不同表达水平对Rheb与mTOR结合的影响,结果发现IL-37d的表达对Rheb与mTOR的结合量没有明显的影响,提示IL-37d不是通过竞争性抑制Rheb和mTOR的结合而发挥效应的。(四)IL-37d通过抑制Rheb活性进而下调mTORC1通路为了进一步探究IL-37d是否通过抑制Rheb进而下调mTORC1信号通路,我们在细胞中共同表达了IL-37d和Rheb两种质粒,首先在基础状态下,采用Western-blot和流式细胞术检测p-S6的表达情况,结果发现单独过表达Rheb后,p-S6表达上调,说明Rheb的过表达可活化mTORC1通路;但同时过表达IL-37d后,这种抑制作用被逆转,说明IL-37可通过抑制Rheb进而下调mTORC1的通路。为了进一步确定IL-37d的作用,我们共转染IL-37d和活性Rheb两种质粒,用无FBS无精氨酸无亮氨酸的培养基饥饿两个小时,Western-blot和流式细胞术检测p-S6的表达情况,结果均显示IL-37d可以逆转活性Rheb对p-S6的活化。证明IL-37d通过抑制Rheb的活性进而下调mTORC1信号通路。三、IL-37d抑制mTORC1信号通路介导的肝脏脂质积累已知mTORC1信号通路活化在肝脏脂质积累中发挥促进作用,为了在体内研究IL-37d对mTORC1信号通路的影响及在肝脏脂质积累中的作用,我们分别利用长期高脂饮食诱导的肝脏脂质积累模型和饥饿16小时诱导的肝脏短期脂质积累模型,对此进行了研究。(一)IL-37d抑制高脂诱导的mTORC1信号通路的活化及肝脏脂质积累选择6～8周的雄性IL-37d转基因和WT小鼠进行高脂饮食,18周后对小鼠解剖。发现IL-37d转基因小鼠体重和肝重明显降低。免疫组化和Western-blot检测均发现IL-37d转基因组小鼠较WT组小鼠p-S6的表达明显降低,说明IL-37d抑制高脂诱导的mTORC1信号通路的活化。HE染色和肝内脂质含量检测发现IL-37d转基因小鼠肝脏细胞中的脂滴较WT小鼠减小、肝内甘油三酯含量明显降低,说明IL-37d抑制mTORC1信号通路介导的肝脏脂质积累。(二)IL-37d抑制禁食16小时诱导的mTORC1信号通路的活化及肝脏短期脂质积累6～8周的雄性IL-37d转基因和WT小鼠,禁食16小时建立肝脏内短期的脂质积累模型。免疫组化和Western-blot检测均发现IL-37d转基因组小鼠较WT组小鼠p-S6的表达明显降低,说明IL-37d抑制禁食16小时诱导的mTORC1信号通路的活化。肝内脂质含量检测发现IL-37d转基因小鼠比WT小鼠甘油三酯含量较低,说明IL-37d抑制mTORC1信号通路介导的肝脏短期脂质积累。结论1.IL-37d抑制mTORC1信号通路。2.IL-37d通过抑制Rheb的活性下调mTORC1信号通路。3.IL-37d抑制mTORC1信号通路介导的肝脏脂质积累,缓解由过度脂质积累造成的脂肪肝现象。创新性和意义1.提出IL-37d作为一种内源性“雷帕霉素”抑制mTORC1通路的新机制:发现IL-37d可以抑制mTORC1信号通路并证明IL-37d通过抑制Rheb活性下调mTORC 1信号通路,丰富了人们对IL-37的功能和机制的认识以及对调控mTORC1的机制的理解。2.发现IL-37除了抗炎作用之外,还参与脂质代谢等过程:本课题发现IL-37可抑制mTORC1信号通路介导的肝脏脂质积累,缓解由过度脂质积累造成的脂肪肝现象,为IL-37用于代谢性疾病的治疗提供了依据。局限性1.IL-37d调控mTORC1信号通路的机制还不够充分和深入。2.需要探究IL-37d调控mTORC1信号通路在多种疾病模型中的作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R575
【部分图文】：
图１人ＩＬ－３７的基因结构??（Ｄｉａｎａ?Ｂｏｒａｓｃｈｉ?ｅｔ?ａｌ．，?Ｅｕｒ?Ｃｙｔｏｋｉｎｅ?Ｎｅｔｗ．?２０１１）??
ＡＭＰＫ??图２?ＩＬ－３７的作用机制??（Ａｙｏｕｂ?Ａｂｕｌｋｈｉｒ?ｅｔ?ａｌ．，?Ｊ?Ｌｅｕｋｏｃ?Ｂｉｏｌ．?２０１７?）?（?Ｙｕｌａｎ?Ｌｉ，ｅｔ??ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０１７）?（Ｍｉｎｇｓｈｅｎｇ?Ｚｈａｏ?，ｅｔ?ａｌ．，?Ｃｅｉｌ?Ｄｅａｔｈ?？＆?Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１８）??二?ｘ?ＩＬ－３７ｂ?与?ｍＴＯＲ??
、．?ｗ?ｉ图４?ｍＴＯＲＣｌ下游信号通路??（Ｃｅｌｌ?Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ?ｄｉａｇｒａｍ）??ｌ的激活??Ｃｌ的激活需要营养物质，营养物质包括氨基酸（主要是亮氨
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本文编号：
2884423
