丙型肝炎病毒的检测及基因分型新方法

发布时间：2020-12-25 18:58

　　丙型肝炎病毒（HCV）在全世界约有1.7亿感染者，由于其疫苗难以研制且尚无特效药，因此，对丙型肝炎的早期诊断是非常有意义的。现阶段对丙肝的常规诊断方法为PCR与ELISA，二者虽属于成熟的检测方式，但均较为耗时，操作繁琐，HCV的检测急需简便且灵敏的方法。本文利用分子信标与金纳米颗粒针对HCV病毒RNA做了一系列检测及基因分型的实验。首先是使用Duplex-specific nuclease（DSN）作为分子信标的信号放大工具，针对HCV RNA做了直接检测。同时，还有利用该探针对HCV RNA的PCR产物进行检测达到基因分型目的的实验。另外，应用金纳米颗粒，我们对HCVRNA做了灵敏而简易的检测。（1）通过DSN对MB与RNA的杂交产物进行酶切，可实现RNA的重复利用，杂交信号得到了放大。DSN能将MB的检测灵敏度提高2000倍以上。对于JFH1RNA标准样品，我们在较低的浓度下将其检测了出来。然后，实验检测了huh7.5阳性细胞的RNA。对于血清RNA样品，此体系也能区分其阴性与阳性，且信号强弱与ELISA结果一致。（2）利用MB对PCR产物进行检测，即可知道模板除开引物外，其他位... 

【文章来源】：湖南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
第1章 绪论
    1.1 丙型肝炎的现状
    1.2 丙型肝炎的常规检测方式
        1.2.1 实时荧光定量 PCR
        1.2.2 酶联免疫法
    1.3 分子信标的性质及其应用
        1.3.1 分子信标的基本原理与特点
        1.3.2 一些非常规的分子信标介绍
        1.3.3 分子信标的应用
        1.3.4 一些放大分子信标信号的方法
        1.3.5 本文关于 MB 检测 HCV 的设想
    1.4 金纳米颗粒的性质及其应用
        1.4.1 金纳米颗粒的性质与特点
        1.4.2 金纳米颗粒在生物及医学方面的应用
        1.4.3 利用金纳米颗粒针对 HCV RNA 的简单检测方法
        1.4.4 本文拟采用金颗粒检测 JFH1 RNA 的实验
第2章 分子信标与 DSN 对 HCV RNA 的超灵敏检测
    2.1 前言
    2.2 实验试剂与仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 JFH1 RNA 的体外转录
        2.3.2 JFH1 标准 RNA 与分子信标的杂交
        2.3.3 huh7.5 细胞系的培养、感染以及 RNA 提取
        2.3.4 血清 RNA 的提取
        2.3.5 RNA 的琼脂糖凝胶电泳
        2.3.6 小片段靶点 RNA 与分子信标的杂交
        2.3.7 血清样品的 ELISA 检测
        2.3.8 在 DSN 的辅助下以分子信标检测 RNA
        2.3.9 细胞 RNA 的样品的 PCR 检测
    2.4 实验结果与讨论
        2.4.1 分子信标与 JFH1 RNA 的杂交反应
        2.4.2 DSN 对分子信标信号放大的可行性探究
        2.4.3 DSN 与分子信标检测 RNA 时的条件优化
        2.4.4 DSN 对分子信标检测 RNA 放大效率的检测
        2.4.5 DSN 与分子信标对 JFH1 RNA 在较低浓度的检测
        2.4.6 DSN 与分子信标对 huh7.5 阳性细胞中 HCV RNA 的检测
        2.4.7 DSN 与分子信标对血清样品中 HCV RNA 的检测
    2.5 本章小结
第3章 利用分子信标针对 HCV 的基因分型
    3.1 引言
    3.2 实验试剂及仪器
    3.3 实验方法
        3.3.1 逆转录与普通 PCR
        3.3.2 琼脂糖凝胶电泳
        3.3.3 分子信标与 PCR 产物的杂交反应
    3.4 实验结果
        3.4.1 分子信标与 PCR 产物杂交的可行性探究
        3.4.2 分子信标与 PCR 产物杂交的条件优化
        3.4.3 分子信标分别检测 H77S 与 JFH1 PCR 产物
    3.5 本章小结
第4章 利用金纳米颗粒对 JFH1 RNA 的直接检测
    4.1 引言
    4.2 实验试剂与仪器
    4.3 实验方法
        4.3.1 金纳米颗粒检测体系的建立
        4.3.2 在此检测体系中 JFH1 RNA 与引物的杂交
        4.3.3 反应结束后金颗粒体系的吸光度测定
    4.4 实验结果
        4.4.1 金纳米颗粒检测 JFH1 RNA 的可行性研究
        4.4.2 金纳米颗粒检测 JFH1 RNA 实验的条件优化
        4.4.3 金纳米颗粒对 JFH1 RNA 的检测
        4.4.4 在复杂体系中金纳米颗粒对 JFH1 RNA 的检测
    4.5 本章小结
结论与展望
参考文献
附录 攻读学位期间参与项目及发表论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J]. 陈旭,齐凤坤,康立功,李景富.  东北农业大学学报. 2010(08)
[2]实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展[J]. 赵焕英,包金风.  中国组织化学与细胞化学杂志. 2007(04)
[3]NASBA荧光分子信标技术定量检测丙型肝炎病毒[J]. 王虹,陈金华,曾位森,刘丹,杨艳妮,蒋平,谢曙光.  中国生物工程杂志. 2003(12)
[4]SMD残留检测的ELISA方法的建立和初步应用[J]. 周新民,陈连颐,王捍东,王宗元.  畜牧与兽医. 2003(10)
[5]纳米金修饰玻碳电极在抗坏血酸共存下选择性测定多巴胺[J]. 张宏,桂学琴,金葆康.  分析科学学报. 2002(03)



本文编号：2938217