KLF9通过诱导PGC-1α调节小鼠原代肝脏细胞抗ROS基因的表达
发布时间：2021-04-02 12:24
反应活性氧的产生与清除失衡,会导致组织和细胞受到氧化损伤。现在,普遍认为在神经退行性疾病和心血管等疾病的发生发展过程中氧化应激起重要作用,但是其中的分子机制仍不是很清楚。KLF9在大脑和肝脏中的表达相对较高,但是其在反应活性氧方面方面的作用机制仍然不清楚。过氧化物酶体增殖激活受体γ激活因子1α （PGC-1α）能共激活多种转录因子,如ERRα和PARγ,从而调节细胞内ROS的水平。为了研究KLF9调节小鼠原代肝脏细胞抗ROS基因表达的分子机制,本课题利用过表达和敲低KLF9的腺病毒Ad-KLF9、Ad-shKLF9感染野生型小鼠原代肝脏细胞,并在野生型小鼠和KLF9KO小鼠原代肝脏细胞中通过PGC-1α的拯救实验,用real time PCR和western blot检测抗ROS基因（CAT,SOD2,和GPx1）的表达。H202可以刺激野生型小鼠原代肝脏细胞抗ROS基因的表达,该刺激作用在KLF9KO小鼠肝脏细胞中明显降低。双荧光报告实验证明KLF9可以激活PGC-1α基因的启动子。在野生型小鼠的原代肝脏细胞中过表达KLF9,抗ROS基因的表达水平明显上调,敲低KLF9的内源性表达,...
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
材料与方法
1. 实验材料
1.1 实验动物
1.2 菌株和细胞系
1.2.1 细菌菌株
1.2.2 细胞系
1.3 质粒载体
1.4 工具酶以及分子量标准
1.5 试剂盒
1.6 化学试剂（按试剂公司分类）
1.7 主要仪器及设备
1.8 分析软件
1.9 实验所用引物
2. 实验方法
2.1 质粒载体的构建
2.1.1 PCR法扩增目的片段
2.1.2 PCR点突变KLF9在PGC-1α基因启动子上的结合位点
2.1.3 DNA琼脂糖凝胶电泳
2.1.4 DNA凝胶回收（Axygen试剂盒）
2.1.5 DNA及载体的酶切
2.1.6 片段与载体的连接
2.1.7 连接产物的转化
2.1.8 阳性克隆的筛选
2.1.9 质粒DNA的大量制备
2.2 细胞培养
2.2.1 细胞培养条件
2.2.2 细胞的复苏
2.2.3 细胞的传代培养
2.2.4 细胞的冻存
2.2.5 细胞的计数
2.3 细胞的瞬时转染
2.4 双荧光素酶报告实验测定启动子活性
2.5 总RNA提取及cDNA合成
2.5.1 总RNA的提取
2.5.2 总RNA逆转录合成cDNA
2.6 Real-Time PCR实验
2.7 细胞蛋白质的分离提取
2.7.1 溶液配制
2.7.2 蛋白样品的制备
2.7.3 BCA法测定蛋白质样品的浓度
2.8 Western blot
2.8.1 试剂配制
2.8.2 SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS—PAGE）
2.8.3 转膜
2.8.4 封闭及杂交
2.8.5 发光鉴定
2.9 重组腺病毒的构建与包装
2.10 小鼠肝原代细胞的分离以及培养
2.10.1 实验物品
2.10.2 溶液
2.10.3 步骤
2.11 统计分析
实验流程
实验结果
2O2刺激小鼠的原代肝脏细胞抗ROS基因的表达"> 1. H2O2刺激小鼠的原代肝脏细胞抗ROS基因的表达
2. KLF9可以激活小鼠PGC-1α基因的启动子
3. KLF9基因过表达腺病毒的包装及原代肝细胞水平验证
4. 过表达KLF9激活小鼠原代肝脏细胞抗ROS基因的表达
5. 干扰KLF9减弱小鼠原代肝脏细胞抗ROS基因的表达
6. KLF9通过PGC-1α来调节抗ROS基因的表达
讨论
小结
参考文献
综述
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Glutathione Peroxidase Revisited—Simulation of the Catalytic Cycle by Computer-Assisted Molecular Modelling[J]. K. -D. AUMANN; N. BEDORF; R. BRIGELIUS-FLOHED;D. SCHOMBURG; AND L. FLOHE(Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig, Germany; Deutsches Institut fur Ernahrungsforschung (DIfE) Arthur-Scheunert-Allee 114. Biomedical and Environmental Sciences. 1997(Z1)
本文编号：3115274
【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
材料与方法
1. 实验材料
1.1 实验动物
1.2 菌株和细胞系
1.2.1 细菌菌株
1.2.2 细胞系
1.3 质粒载体
1.4 工具酶以及分子量标准
1.5 试剂盒
1.6 化学试剂（按试剂公司分类）
1.7 主要仪器及设备
1.8 分析软件
1.9 实验所用引物
2. 实验方法
2.1 质粒载体的构建
2.1.1 PCR法扩增目的片段
2.1.2 PCR点突变KLF9在PGC-1α基因启动子上的结合位点
2.1.3 DNA琼脂糖凝胶电泳
2.1.4 DNA凝胶回收（Axygen试剂盒）
2.1.5 DNA及载体的酶切
2.1.6 片段与载体的连接
2.1.7 连接产物的转化
2.1.8 阳性克隆的筛选
2.1.9 质粒DNA的大量制备
2.2 细胞培养
2.2.1 细胞培养条件
2.2.2 细胞的复苏
2.2.3 细胞的传代培养
2.2.4 细胞的冻存
2.2.5 细胞的计数
2.3 细胞的瞬时转染
2.4 双荧光素酶报告实验测定启动子活性
2.5 总RNA提取及cDNA合成
2.5.1 总RNA的提取
2.5.2 总RNA逆转录合成cDNA
2.6 Real-Time PCR实验
2.7 细胞蛋白质的分离提取
2.7.1 溶液配制
2.7.2 蛋白样品的制备
2.7.3 BCA法测定蛋白质样品的浓度
2.8 Western blot
2.8.1 试剂配制
2.8.2 SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS—PAGE）
2.8.3 转膜
2.8.4 封闭及杂交
2.8.5 发光鉴定
2.9 重组腺病毒的构建与包装
2.10 小鼠肝原代细胞的分离以及培养
2.10.1 实验物品
2.10.2 溶液
2.10.3 步骤
2.11 统计分析
实验流程
实验结果
2O2刺激小鼠的原代肝脏细胞抗ROS基因的表达"> 1. H2O2刺激小鼠的原代肝脏细胞抗ROS基因的表达
2. KLF9可以激活小鼠PGC-1α基因的启动子
3. KLF9基因过表达腺病毒的包装及原代肝细胞水平验证
4. 过表达KLF9激活小鼠原代肝脏细胞抗ROS基因的表达
5. 干扰KLF9减弱小鼠原代肝脏细胞抗ROS基因的表达
6. KLF9通过PGC-1α来调节抗ROS基因的表达
讨论
小结
参考文献
综述
参考文献
附录
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Glutathione Peroxidase Revisited—Simulation of the Catalytic Cycle by Computer-Assisted Molecular Modelling[J]. K. -D. AUMANN; N. BEDORF; R. BRIGELIUS-FLOHED;D. SCHOMBURG; AND L. FLOHE(Gesellschaft fur Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig, Germany; Deutsches Institut fur Ernahrungsforschung (DIfE) Arthur-Scheunert-Allee 114. Biomedical and Environmental Sciences. 1997(Z1)
本文编号：3115274
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