PKCδ激活对肝细胞内质网应激和脂肪变性的调控作用

发布时间：2017-04-27 18:06

  本文关键词：PKCδ激活对肝细胞内质网应激和脂肪变性的调控作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的： 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)在近几十年已经成为常见的公共健康问题。NAFLD包含了从单纯性脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的临床疾病状态，能发展为肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌。目前广泛接受的理论是“二次打击”学说，该学说认为，以胰岛素抵抗为首的“一次打击”是引起肝细胞脂肪变性的主要原因，在此基础上，以内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、线粒体功能障碍为标志的“二次打击”导致了单纯性脂肪肝向NASH的演进。 ERS在NASH肝细胞损伤中发挥重要作用，是目前的研究热点，但机制不明。结合免疫球蛋白Bip,又称GRP78或HspA5,是位于内质网中重要的分子伴侣,被认为是内质网应激标志性蛋白之一。剪切型X盒结合蛋白XBP-1s(spliced X-box bindingprotein1)不仅可以与内质网应激的反应元件(endoplasmic reticulum stress responseelement, ERSE)结合诱导Bip、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)基因的转录活性，而且能够诱导内质网降解增强因子-α甘露糖苷酶样蛋白(ER degradation-enhancing-mannosidase-like protein，EDEM)基因的转录，因此XBP-1s表达上调被认为是内质网应激的另一标志。 蛋白激酶C(protein kinase C，，PKC)是存在于哺乳动物细胞胞浆内的丝/苏氨酸蛋白激酶，具有脂质依赖性,至少包括12种亚型。PKCδ是新型PKC(novel PKC, nPKC)家族成员，主要在肝脏组织中发挥作用。与cPKC和aPKC不同，PKCδ能被游离脂肪酸的代谢产物二酰甘油(diacylglycerol，DAG)激活，并通过激活应激活化蛋白激酶(c—junN—terminal kinase，JNK)和CHOP，促进肝细胞凋亡的发生。研究发现，PKCδ激活与糖尿病及其相关疾病发病机制密切相关。将编码PKCδ的Prkcd基因经整体或者肝特异性敲除后，小鼠肝脏胰岛素敏感性得到明显改善。与高脂饮食饲养野生型同窝对照小鼠相比较，Prkcd-/-小鼠肝脏和血浆甘油三酯水平及附睾脂肪组织都减少。这些线索提示：在NASH发生发展过程中，PKCδ参与肝细胞脂肪变性过程，其激活很可能是诱导ERS持续发生导致肝细胞脂肪变进展至NASH发生的关键环节，但目前尚无PKCδ与ERS之间关系的研究。因此，本研究目的在于初步探讨PKCδ与肝细胞脂肪变性、内质网应激的关系，为防治非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)向NASH的演进提供新思路。 方法： 1.构建肝细胞株L02脂肪变性体外模型 1.1.人正常肝细胞株L02培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，造模前细胞进行胎牛血清剥夺过夜。对照组培养于含1%FAF-BSA的DMEM培养基培养，脂肪酸组给予0.5mM长链游离脂肪酸(long-chain fatty acids，LCFA)，油酸/棕榈酸酯，2:1。根据诱导脂肪变的时间，脂肪酸组分为2h组、4h组、8h组和16h组。 1.2油红O染色检测各组细胞内脂滴含量。 1.3检测各组细胞内甘油三酯(TG)含量。 2Real-time PCR检测PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平的表达变化。 3Western-blot检测PKCδ、Bip、XBP-1s在蛋白水平的表达变化。 4检测PKCδ对内质网应激标志蛋白Bip、XBP-1s的影响。 4.1利用siRNA瞬时转染技术降低PKCδ基因的表达。 4.2检测干扰PKCδ表达后Bip、XBP-1s的mRNA水平的表达变化。 4.3检测干扰PKCδ表达后Bip、XBP-1s的蛋白水平的表达变化。 5检测干扰PKCδ表达后对L02肝细胞脂肪变性程度的影响。 6利用SPSS18.0软件，对各项实验数据进行统计学分析。 结果： 1油酸/棕榈酸(2:1)体外诱导成功建立L02细胞脂肪变性模型 油红O染色检测脂肪酸组细胞内橘红色脂滴明显增多，且随着培养时间的延长脂滴越为明显。ImageJ2X图像分析提示L02细胞单个细胞平均脂变面积显示，脂肪酸组较对照组脂滴含量明显增多(P0.01)。经油酸、棕榈酸诱导处理后的L02细胞内TG含量也随培养时间的延长而升高，明显高于对照组(P＜0.05)。 2Real-time PCR检测PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平的表达变化。 与对照组相比，脂肪酸组的L02细胞PKCδ、Bip、XBP-1s的mRNA水平显著增加，且具有时间依赖效应(P＜0.05)。 3Western-blot检测PKCδ、Bip、XBP-1s在蛋白水平的表达变化。 脂肪酸组PKCδ、Bip、XBP-1s蛋白水平的表达均较对照组增高。利用PKCδ充分激活所必须的磷酸化位点Thr-505检测PKCδ激活状态，与对照组相比，混合脂肪酸刺激L02肝细胞早期阶段，PKCδ磷酸化表达明显升高，以4h组最为显著，后期出现下降趋势。 4干扰PKCδ表达后对L02细胞Bip、XBP-1s的影响 Real-time PCR和Western-blot检测转染后细胞中Bip、XBP-1s的表达变化，在PKCδ siRNA转染组细胞中，加入脂肪酸培养8h后Bip、XBP-1s表达虽然仍有升高，但程度明显低于对照转染组(P＜0.05)。 干扰PKCδ表达后对L02肝细胞脂肪变性程度的影响 油红O染色检测脂肪变性阳性细胞率，脂肪酸诱导PKCδ siRNA转染组细胞染色阳性率明显低于对照组细胞(P＜0.01), PKCδ siRNA转染组细胞TG含量也显著低于对照组(P＜0.05)。 结论： 1肝细胞脂肪变性过程中，PKCδ及其磷酸化表达、Bip、XBP-1s表达上调，具有时间依赖效应。 2通过siRNA瞬时转染技术降低PKCδ表达能够有效抑制混合脂肪酸诱导内质网应激标志蛋白Bip和XBP-1s的表达，一定程度减轻肝细胞脂肪变性。 3PKCδ可能是NASH发生过程中联系肝细胞脂质过载和内质网应激的关键点。PKCδ的上调可诱导脂质在内质网腔内蓄积并启动内质网应激的发生。
【关键词】：非酒精性脂肪性肝炎 蛋白激酶C 肝细胞脂肪变性 内质网应激
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.5
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-9
• 摘要9-12
• 1. 前言12-15
• 2. 材料与方法15-26
• 3. 结果与分析26-37
• 4. 讨论37-42
• 全文结论42-43
• 参考文献43-47
• 文献综述 内质网应激在 NAFLD“二次打击”假说中的新角色47-55
• 参考文献52-55
• 攻读硕士学位期间发表的论文55-56
• 致谢56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 赖姝婕;陈东风;;PKCδ及相关信号通路在NASH发生中作用的研究进展[J];国际消化病杂志;2013年02期

2 Xue-Qun Zhang;Cheng-Fu Xu;Chao-Hui Yu;Wei-Xing Chen;You-Ming Li;;Role of endoplasmic reticulum stress in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2014年07期

  本文关键词：PKCδ激活对肝细胞内质网应激和脂肪变性的调控作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：331142