原发性胆汁性肝硬化患者IncRNA表达谱芯片分析及功能研究

发布时间：2017-04-30 21:13

  本文关键词：原发性胆汁性肝硬化患者IncRNA表达谱芯片分析及功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：长链非编码RNA (Long non-coding RNA, lncRNA)是指核苷酸长度大于200个碱基的不具有蛋白质编码功能的RNA分子。起初认为lncRNA不具备生物学功能,但是越来越多的研究证实IncRNA经折叠后可以形成特定的空间结构,在表观遗传层面、转录和转录后修饰层面以及翻译过程中调控特定基因的表达,在许多生理和病理过程中发挥重要调节作用。已有不少研究证实了肝癌、胃癌、前列腺癌中1ncRNA存在异常表达或序列突变,参与肿瘤的增殖、侵袭、转移；并且还可作为肿瘤诊断、分期、预后的独立预测指标。IncRNA在免疫细胞分化、固有免疫和适应性免疫应答中同样发挥重要调控作用。lnc-DC只在人类树突状细胞(Dendritic cells, DC)中特异性表达,通过与转录因子STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3)结合,促进单核细胞向DC分化,同时增强DC活化T细胞的能力。X染色体上存在许多与机体免疫功能相关的基因如肿瘤坏死因子a (Tumor necrosis factor-a, TNF-a)、CD40配体(Cell differentiation ligand, CD40L)、叉头状转录因子P3 (Forkhead box P3, FOXP3),而长链非编码RNA Xist (X inactive specific transcript, Xist)参与X染色体失活过程,Xist的序列结构或功能的改变可能导致X染色体上免疫相关基因的表达异常,这或许可以部分解释许多自身免疫性疾病中女性易感的现象。原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis, PBC)是一种以肝内中、小胆管损伤导致胆汁淤积,同时患者血清出现疾病特异的抗线粒体抗体(Anti-mitochondrial antibody, AMA),并伴有碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)、谷氨酰转肽酶(Gamma glutamyl transferase, GGT)等生化指标升高为主要特征的器官特异性自身免疫性疾病,好发于中老年女性,近年来随着自身抗体检测的普及和应用,发病率在逐年上升。感染、环境因素、遗传因素以及表观遗传学因素等均有可能参与PBC的发病,但具体发病机制仍不明确。对于IncRNA在PBC中的研究目前还相对较少,无论是肝组织还是外周血中。本课题对PBC患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中IncRNA表达谱的研究可以为PBC的发病机理提供新的思路,也可以为PBC的临床诊断、治疗提供新的途径。第一部分：PBC患者IncRNA表达谱芯片分析及RT-PCR验证本部分研究收集PBC及健康对照组外周抗凝血各30例,分离PBMC,从中各选取4例进行IncRNA表达谱芯片测定,旨在利用芯片筛选出PBC患者PBMC中差异表达的lncRNA,并用RT-PCR验证芯片结果。相比健康对照组,PBC组中共发现749个异常表达的lncRNA,其中541个上调,208个下调。230个异常表达的mRNA,其中184个上调,46个下调。从差异表达的lncRNA谱中选取6个(uc003xrr、 ucOlOnh、pll02447、NR_026777、ENST00000442026、ENST00000431157)扩大样本量验证芯片结果的可靠性,结果这6个差异的lncRNA在PBC组中的表达水平与芯片结果相符合。第二部分：lncRNA表达谱芯片生物信息学分析本部分主要通过对第一部分得到的749个差异lncRNA进行C is-/Trans-靶基因的GO (Gene ontology, GO)、Pathway分析,以及构建lncRNA与mRNA共表达网络图,分析这些异常表达的lncRNA参与的细胞功能和信号通路,为进一步探究lncRNA在PBC中的作用机制提供理论基础,指明研究方向。结果Cis/trans靶基因pathway分析提示这些差异表达的lncRNA作用的靶基因主要是与细胞凋亡及代谢途径相关。NR4A核受体亚家族广泛参与各种信号转导通路,如MAKP、NF-KB、 PI3K/JNK、Wnt等,调控细胞凋亡、细胞增殖、细胞迁移、脂质代谢、血管形成以及DNA损伤修复等多种细胞生物学过程。纵观芯片中各基因的mRNA表达水平发现,其成员之一NR4A3基因的表达水平下调0.22倍,P值为0.0082。综合分析芯片上各位点的表达水平,发现NR4A3基因下游2万bp左右的位置处lncRNALOC441461的表达水平与其相反,上调2.56倍,P值为0.0015。综合三个权威数据库的结果确定LOC446C61为非编码RNA。在CatRapid网站在线预测LOC441461与PRC2复合物结合的可能性,结果发现在LOC441461的核苷酸序列第439-554核苷酸位置处存在PRC2复合物的结合位点,其中451-552位置处的辨识度高达94%,预示它们之间极有可能发生相互作用。因此,我们猜想PBC患者中LOC441461或许通过招募PRC2复合物,使NR4A3基因启动子区甲基化,进而下调NR4A3基因的表达水平,触发一系列生物学效应,促进疾病的发生发展。第三部分：linc-pbc靶点验证及功能探究本部分我们检测了linc-pbc和NR4A3在PBC组、疾病对照组和健康对照组中的表达水平,发现在PBC组中这两者的表达水平与芯片结果相符,P0.001,差异有统计学意义。在系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)患者中linc-pbc及NR4A3的表达模式与PBC类似,而乙肝肝硬化(Hepatitis B virus,HBV)患者中这二者的表达水平与对照组无显著性差异。设计siR NA对linc-pbc进行干扰,观察NR4A3、FOXP3的mRNA以及蛋白表达水平的是否有变化。同时检测转染siRNA后PBMC的凋亡情况。本研究发现转染针对linc-pbc的siRNA后,PBMC中linc-pbc的水平下降,而NR4A3的mRNA表达水平及蛋白质水平均上调,FOXP3的水平也上调,这说明line-pbc可能确实可以通过与PRC2复合物结合,抑制NR4A3的表达；而NR4A3表达水平的降低将导致其调控转录的活性降低,进一步引起下游靶基因FOXP3的表达下调,导致循环外周血液及肝脏组织局部具有免疫抑制功能的Treg细胞减少,打破机体免疫耐受平衡状态,从而诱发疾病。但另一方面,转染siRNA后,细胞凋亡水平与阴性对照组并无明显差异,可能是由于转染的PBMC是从健康人中分离的,而这些健康人的细胞可能存在一定的损伤修复机制,单独干扰line-pbc虽然可以使NR4A3的表达上升,但可能尚不足以引起明显的细胞凋亡现象。又或者,NR4A3仅仅促进自身反应性T淋巴细胞的凋亡。结论PBC患者PBMC中,相对于健康对照组,共发现749个异常表达的lncRNA,其中541个上调,208个下调。230个异常表达的mRNA,其中184个上调,46个下调。NR4A3基因的表达水平下调0.22倍,P值为0.0082。在NR4A3基因下游的lncRNA LOC441461的表达水平与其相反,上调2.56倍,P值为0.0015。LOC441461或许通过招募PRC2复合物,使NR4A3基因启动子区甲基化,从而下调NR4A3基因的表达水平,而下调的NR4A3调控靶基因转录的活性降低,使得下游的靶基因FOXP3的表达下降,进而导致外周血及肝组织局部具有免疫抑制功能的Treg细胞数量减少,打破机体免疫耐受平衡状态,促进疾病的发生、发展。
【关键词】：长链非编码RNA 原发性胆汁性肝硬化 NR4A3 LOC441461 PRC2复合物
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2;R440
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 中英文缩略词表11-13
• 前言13-16
• 第一部分 PBC患者lncRNA表达谱芯片分析及RT-PCR验证16-29
• 一、材料与方法16-21
• 二、实验结果21-26
• 三、讨论26-29
• 第二部分 lncRNA表达谱芯片生物信息学分析29-36
• 一、材料与方法30-31
• 二、实验结果31-34
• 三、讨论34-36
• 第三部分 linc-pbc靶点验证及功能探究36-46
• 一、材料与方法36-41
• 二、实验结果41-44
• 三、讨论44-46
• 结论46-47
• 参考文献47-51
• 综述51-57
• 参考文献55-57
• 在读期间发表论文57-58
• 致谢58-59

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 Tianzhi Huang;Angel Alvarez;Bo Hu;Shi-Yuan Cheng;;Noncoding RNAs in cancer and cancer stem cells[J];Chinese Journal of Cancer;2013年11期

2 Wenwen Jia;Wen Chen;Jiuhong Kang;;The Functions of MicroRNAs and Long Non-coding RNAs in Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

3 杨敏;杨再兴;仲人前;;长链非编码RNA在免疫系统中的研究进展[J];国际检验医学杂志;2013年24期

4 张双玲;江高峰;吴磊;杜柳涛;;长链非编码RNA在卵巢癌研究中的进展[J];公共卫生与预防医学;2014年02期

5 陈素莲;朱丽华;卢晓辉;赵遵兰;王洋洋;周继红;陈昌杰;杨清玲;;三氧化二砷对乳腺癌细胞长链非编码RNA HOX转录反义RNA的作用[J];蚌埠医学院学报;2014年06期

6 杜立中;章丽燕;;重视生命早期营养与远期肺部疾病的关系[J];第三军医大学学报;2014年22期

7 宿娅;张晨芳;魏强;李广林;;长链非编码RNA研究进展[J];西北植物学报;2014年11期

8 李艳艳;顾志良;;长链非编码RNA在肌肉发育中的作用研究进展[J];中国畜牧兽医;2014年11期

9 邱君君;华克勤;;长链非编码RNA及其在妇科肿瘤发生发展中的作用[J];国际妇产科学杂志;2015年01期

10 尚春亮;姚书忠;;长链非编码RNA与妇科恶性肿瘤的相关性研究[J];国际妇产科学杂志;2015年01期

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 杨艳辉;1、第一部分 单核细胞亚群在原发免疫性血小板减少症中的分布及功能研究 2、第二部分 IL-35在原发免疫性血小板减少症中的表达及其临床意义[D];北京协和医学院;2013年

2 张馨予;盐敏感高血压干预新靶标的探索性研究[D];北京协和医学院;2013年

3 刘新林;ST段抬高型心肌梗死急性期单核细胞亚群与单核细胞—血小板聚集体的动态变化规律及临床意义[D];天津医科大学;2013年

4 郭杏莉;基于网络模型的基因相关预测问题算法研究[D];西安电子科技大学;2013年

5 杨国红;逆转录病毒中介的VEGF-C/VEGFR-3信号通路调节对高盐摄入诱导的高血压性左心室重塑的干预作用[D];天津医科大学;2013年

6 赵为民;猪胚胎骨骼肌中基因间长非编码RNA的鉴定、特征及功能的初步分析[D];中国农业科学院;2013年

7 谷甜甜;Rian基因的表达调控及与Dlk1-Dio3印记区间的关系研究[D];哈尔滨工业大学;2012年

8 兰波;非编码RNA PCA3的功能研究[D];北京协和医学院;2012年

9 陈香嵩;组蛋白甲基化与DNA甲基化的相互作用及其表观遗传机制的研究[D];华中农业大学;2012年

10 王品;非编码RNA对人NK细胞与树突状细胞免疫功能的调控作用及相关机制研究[D];第二军医大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 车建花;RERT-lncRNA中的一个4bp插入/缺失多态与多种肿瘤易感的关联性分析[D];苏州大学;2013年

2 王颖君;树，

本文编号：337624