脐带源间充质干细胞在肝纤维化及肝硬化大鼠体内的肝细胞样分化作用

发布时间：2017-05-26 10:24

  本文关键词：脐带源间充质干细胞在肝纤维化及肝硬化大鼠体内的肝细胞样分化作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝纤维化（hepatic fibrosis, HF）是肝脏对各种不同致病因子引起的慢性炎症、坏死或其他损伤的修复反应，肝硬化则是肝纤维化的终末阶段。此时，肝炎病毒、酒精代谢产物、胆汁酸等肝脏毒性物质作用于肝细胞，肝功能明显下降，同时受损肝细胞释放的AST、ALT、TBIL、DBIL、活性氧（reactive oxygen species, ROS）和纤维形成介质导致自身凋亡。目前肝移植是治疗终末期肝病的唯一有效方法，但由于肝源紧张、免疫排斥等原因限制了肝移植的临床应用。因此亟待寻找新的有效治疗方法。 细胞治疗是指有活性的细胞替代、修复损伤的组织，进而使组织器官恢复其功能的有效治疗方法。近年来细胞治疗已成为替代器官移植的有效治疗方法。其中干细胞治疗肝硬化等终末期肝病的疗效已得到证实。 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种来源于中胚层的具有多向分化潜能的干细胞，广泛存在于骨髓、脐带组织、脐血、外周血及脂肪等组织中，在特定条件下，可以分化为骨细胞、神经细胞、肝细胞等多种细胞。MSCs易于提取，低免疫原性，并且具有免疫抑制作用，避免了肝移植的肝源紧张、移植后免疫排斥等不足，被认为是目前最具治疗潜力的供体细胞。有研究证实骨髓源间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells, BM-MSCs)可以分化为功能性肝细胞，修复损伤的肝组织，从而改善肝纤维化和肝硬化；另有研究发现脂肪源MSCs(adiposetissue-derived mesenchymal stem cells, AT-MSCs)在体外向肝细胞分化过程中经历了间充质细胞向上皮细胞的转变(mesenchymal-to-epithelialtransition, MET)。关于MSCs在体内的动态分化过程及在此分化过程中是否经历了MET尚不清楚。为此，我们构建大鼠肝纤维化及肝硬化模型，经尾静脉注射人脐带源MSCs (human umbilical cord-derived mesenchymalstem cells, hUC-MSCs)，观察hUC-MSCs对肝纤维化、肝硬化的治疗作用，在体内的动态分化过程及分化的具体机制，为hUC-MSCs治疗肝纤维化及肝硬化提供理论依据。 目的：研究hUC-MSCs在肝纤维化及肝硬化大鼠体内的动态分化过程及其分化机制。 方法：将健康成年雄性Wistar大鼠分为对照组（正常大鼠，CCl_4/saline0wk，8只），模型组(肝纤维化模型组：CCl_4/saline4wks，5wks，7wks；肝硬化模型组：CCl_4/saline8wks，10wks，14wks；每组8只)，MSCs移植组(肝纤维化MSCs移植组：CCl_4/MSCs0wk，1wk，2wks，4wks；肝硬化MSCs移植组；CCl_4/MSCs0wk，2wks，4wks，8wks；每组8只)。采用浓度40%CCl_4橄榄油溶液，按2ml/kg体重的剂量，给予四肢轮流皮下注射，每周2次；造模成功后模型组及治疗组继续每周2次皮下注射CCl_4，直至处死。肝纤维化及肝硬化MSCs移植组分别于造模成功后（即CCl_4注射第4周和第7周）经尾静脉注射hUC-MSCs，剂量为5×106个/只，并分别于注射后1、2、4周和2、4、8周处死大鼠。 应用血清学检测方法检测大鼠ALT、AST、ALB、TBIL、DBIL，观察hUC-MSCs移植对大鼠肝功能的影响；采用Haematoxylin and eosinstaining(HE染色)、Masson’s trichrome staining(MT染色)和天狼猩红染色法检测肝组织病理改变；采用免疫荧光染色、Western blot和real-timeQ-PCR方法检测各组大鼠肝脏组织中人来源的ALB、AFP蛋白和mRNA的表达，免疫组织化学染色、Western blot和Real time-PCR方法检测人来源的CK18、CK19、vimentin、α-catenin、E-cadherin蛋白和mRNA在大鼠肝组织中的表达，采用Real time-PCR方法检测人来源的N-cadherin。 结果：①HE、MT及天狼猩红染色结果显示：CCl_4诱导的大鼠肝纤维化和肝硬化模型成功建立，模型组随给药时间的延长，肝细胞变性坏死及肝内纤维组织沉积逐渐增多；与模型组相比，MSCs移植组肝细胞变性坏死有所减少，HE炎症评分、纤维化程度分级及纤维组织沉积定量分析结果显示：与模型组相比，除肝纤维化MSCs移植CCl_4/MSCs1wk组与肝纤维化模型CCl_4/saline4wks组相比无明显差异外，肝纤维化CCl_4/MSCs2wks组、4wks组及肝硬化MSCs移植各组均显示存在显著性差异；②血清学检测结果显示：在肝纤维化MSCs移植组模型中，CCl_4/MSCs1wk组肝功能较CCl_4/saline4wks组无明显改善，在CCl_4/MSCs2wks组中，ALT、AST较CCl_4/saline5wks组中的显著降低，ALB、TBIL、DBIL无明显改善；在肝硬化MSCs移植组模型中，CCl_4/MSCs2wks中的ALB较CCl_4/saline8wks组无明显升高，其余各个时间点MSCs移植组较模型组的肝功能明显好转。③免疫荧光染色及免疫组织化学染色检测结果显示：肝纤维化MSCs移植组中，ALB、AFP、CK18、CK19、E-cadherin及α-catenin表达水平随移植时间的延长表达量逐渐升高，vimentin表达量随MSCs移植时间的延长其含量逐渐下降；在肝硬化MSCs移植组中，随MSCs移植时间的延长，ALB、CK18表达量逐渐增多，vimentin随移植时间的延长其含量逐渐下降，AFP、CK19、E-cadherin及α-catenin在移植后4周较2周组有所增加，移植后8周组较4周组下降，在MSCs移植前以上蛋白均无表达。④应用Western blot检测ALB、AFP、CK18、CK19在大鼠肝脏组织中的表达，在肝纤维化MSCs移植组，CCl_4/MSCs2wks组的ALB、CK18的蛋白表达水平与CCl_4/MSCs1wk组的无显著性差异，而CCl_4/MSCs4wks组的ALB、CK18的蛋白表达较CCl_4/MSCs2wks组的显著升高，随MSCs移植时间的延长，AFP、CK19的蛋白表达水平逐渐升高，以上4种蛋白在MSCs移植前均呈阴性表达；在肝硬化MSCs移植组中，与CCl_4/MSCs2wks组相比，CCl_4/MSCs4wks组的AFP、CK19mRNA表达显著升高，而CCl_4/MSCs8wks组的AFP、CK19mRNA较CCl_4/MSCs4wks组显著下降，CK18、ALB的蛋白随MSCs移植时间的延长而表达增加，其上蛋白在MSCs移植前均为阴性表达。⑤应用real-time Q-PCR检测结果显示：在肝纤维化MSCs移植组中，CCl_4/MSCs2wks组的ALB、CK18mRNA表达水平与CCl_4/MSCs1wk组中的无显著性差异；而CCl_4/MSCs4wks组的ALB、CK18mRNA含量较CCl_4/MSCs2wks组的显著升高，，随MSCs移植时间的延长，AFP、CK19的mRNA表达水平显著升高；在肝硬化MSCs移植组中，与CCl_4/MSCs2wks组相比，CCl_4/MSCs4wks组的AFP、CK19mRNA表达显著升高，而CCl_4/MSCs8wks组中的AFP、CK19mRNA表达含量较CCl_4/MSCs4wks组的显著下降，CK18、ALB mRNA水平随移植时间的延长而表达显著增加，以上几个指标的mRNA在MSCs移植前均无表达。⑥Western blot检测结果显示，在肝纤维化MSCs移植组中，vimentin蛋白随MSCs移植时间的延长而表达下降，随MSCs移植时间的延长，E-cadherin及α-catenin的蛋白表达水平显著增加，以上蛋白在MSCs移植前均为阴性表达；在肝硬化MSCs移植组中，与CCl_4/MSCs2wks组相比，CCl_4/MSCs4wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA表达显著升高，而CCl_4/MSCs8wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA较CCl_4/MSCs4wks组显著下降，随MSCs移植时间的延长，N-cadherin、vimentin mRNA表达水平显著下降，以上蛋白在MSCs移植前均无表达。⑦应用real-time Q-PCR检测结果显示：在肝纤维化MSCs移植组中，N-cadherin、vimentin mRNA随MSCs移植时间的延长而表达下降；随MSCs移植时间的延长，E-cadherin及α-catenin mRNA的表达显著增加；在肝硬化MSCs移植组，与CCl_4/MSCs2wks组相比，CCl_4/MSCs4wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA表达显著升高，而CCl_4/MSCs8wks组的E-cadherin、α-catenin mRNA较CCl_4/MSCs4wks组的显著下降，随MSCs移植时间的延长，N-cadherin、vimentin mRNA表达水平显著下降，N-cadherin、vimentin、E-cadherin及α-catenin在MSCs移植前均无表达。 结论：hUC-MSCs移植对大鼠肝纤维化及肝硬化均具有治疗作用，hUC-MSCs分化为肝细胞样细胞是其治疗机制之一；hUC-MSCs在体内向肝细胞的转化是一个动态分化的过程，在此分化过程中hUC-MSCs经历了MET。
【关键词】：肝纤维化 肝硬化 hUC-MSCs 肝细胞 分化
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-15
• 材料与方法15-32
• 结果32-40
• 附图40-58
• 附表58-59
• 讨论59-63
• 结论63-64
• 参考文献64-67
• 综述 MSCs 分化为功能性肝细胞的研究进展67-79
• 参考文献73-79
• 致谢79-80
• 个人简历80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 胡维亨;任军;;人乙型肝炎病毒DNA阳性血清对人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的影响[J];北京大学学报(医学版);2008年05期

2 王宇明;汤影子;;重型乙型肝炎发病机制研究进展[J];传染病信息;2008年02期

3 吴雄志;赵连三;许倩;张怡;唐红;;骨髓间充质干细胞在肝部分切除模型小鼠体内向肝细胞分化[J];生物医学工程学杂志;2005年06期

4 闫俊卿;韩涛;朱争艳;;人脐带间充质干细胞生物学特性及向类肝细胞的分化[J];世界华人消化杂志;2008年15期

5 何文艳;刘树贤;姜慧卿;;大鼠骨髓间充质干细胞向类肝细胞体外诱导分化[J];世界华人消化杂志;2008年22期

6 邢全台;孙启龙;李栋;邢培祥;马瑞萍;陈丰哲;邵美英;姚永远;关彦彦;;骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞的诱导分化[J];世界华人消化杂志;2009年26期

7 吕璐璐;宋永平;魏旭东;房伯俊;张艳莉;李玉富;;人脐带和骨髓源间充质干细胞生物学特征的对比研究[J];中国实验血液学杂志;2008年01期

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本文编号：396528