慢性乙肝免疫基因治疗质粒的实验研究

发布时间：2017-06-26 05:20

  本文关键词：慢性乙肝免疫基因治疗质粒的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：抗病毒治疗是目前临床上最有效的慢性乙型肝炎治疗手段，核苷类似物和干扰素通过抑制乙肝病毒的复制和合成常被用于临床治疗，其中干扰素还具有一定的免疫调节作用。尽管这些抗病毒药物能够有效降低患者体内的病毒数量，甚至有时可降至检测不到的水平，但停药后很快会出现病情反复，核苷类药物长期用药容易产生耐药性，干扰素治疗疗程长、价格昂贵等。因此，探寻有效的新型治疗方案是治疗慢性乙肝的当务之急。 基因治疗（gene therapy）是将外源性抗病毒因子导入靶细胞内，通过在不同水平细胞因子基因和共刺激分子基因的表达抑制病毒的复制，有效诱导机体产生免疫应答，同时还能避免长期给药引发的耐药性和副作用。作为一种能有效避免引发耐药性和副作用的全新治疗手段，基因治疗的应用前景显得尤为广阔。 选择合适的载体，将目的基因高效导入靶细胞，并获得高效表达是决定基因治疗成败的关键一环。目前临床上应用最广的是基于病毒载体研发的基因治疗剂，其优点是病毒感染细胞能力强，免疫基因能够高效进入靶细胞，基因治疗效果显著；但其缺点是病毒载体自身免疫原性很强，不能反复多次应用，否则机体产生针对载体自身的免疫应答会抵消基因治疗的效果。以质粒为载体的基因治疗剂具有安全性高、生产成本低廉及稳定性好等优点。同时质粒载体自身容量大，能够方便实现目的基因的优势组合，相对于病毒载体而言，质粒载体自身免疫原性低，可以多次反复应用，却不会引发机体针对载体本身的免疫应答。虽然质粒载体在进入细胞方面效率低于病毒载体，但随着科学研究的不断深入，质粒DNA递送技术取得了长足发展，，特别是电穿孔技术的应用，使得质粒进入细胞的效率提升上百倍，与病毒载体的感染效率相接近。 本研究构建了可融合表达人源化小分子抗体靶向干扰素α和人白细胞介素12的免疫基因治疗质粒pVAX-HBVE和可复制型质粒pSVK-HBVE，酶切和测序鉴定显示质粒构建成功，通过ELISA检测质粒在相应细胞系中获得分泌表达，并利用转基因小鼠模型对免疫基因治疗质粒pVAX-HBVE和可复制型质粒pSVK-HBVE进行了初步免疫功能验证，并对其免疫机制进行深入探讨，为该免疫基因治疗质粒的免疫功能全面验证奠定了重要基础。
【关键词】：乙肝 复制型 质粒构建 免疫基因治疗剂 dsFv IFN-α hIL-12 真核表达
【学位授予单位】：曲阜师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 文献综述8-11
• 1 乙型肝炎及其治疗现状8
• 2 基因治疗简介8-9
• 3 乙肝治疗剂目的基因的选择9
• 4 乙肝治疗剂载体9-11
• 第二章 靶向干扰素和白细胞介素-12 的融合表达质粒 PVAX-HBVE 的构建与表达11-21
• 1 材料与仪器11
• 1.1 质粒、菌株与细胞株11
• 1.2 酶和试剂11
• 1.3 主要仪器设备11
• 2 实验方法11-16
• 2.1 重组质粒 pVAX-HBVE 的构建与鉴定11-15
• 2.2 重组质粒 pVAX-HBVE 的体外表达验证15-16
• 3 实验结果16-19
• 3.1 重组质粒 pVAX-HBVE 的构建与鉴定16-17
• 3.2 重组质粒 pVAX-HBVE 瞬时转染 293T 细胞上清中 IFN-α和 hIL-12 表达验证17-18
• 3.3 重组质粒 pVAX-HBVE 初步功能验证18-19
• 4 讨论19-21
• 第三章 可复制型质粒 PSVK-HBVE 的构建、表达与初步功能验证21-31
• 1 材料与仪器21
• 1.1 质粒、菌株、细胞株与实验动物21
• 1.2 酶和试剂21
• 1.3 主要仪器设备21
• 2 实验方法21-26
• 2.1 重组质粒 pSVK-HBVE 的构建与鉴定21-25
• 2.2 重组质粒 pSVK-HBVE 的体外表达与初步功能验证25-26
• 3 实验结果26-29
• 3.1 重组质粒 pSVK-HBVE 的构建与鉴定26-27
• 3.2 重组质粒 pSVK-HBVE 瞬时转染 293T 细胞上清中 IFN-α和 hIL-12 表达验证27-28
• 3.3 重组质粒 pSVK-HBVE 初步功能验证28-29
• 4 讨论29-31
• 第四章 结论31-32
• 附录：缩略语索引32-33
• 参考文献33-36
• 在校期间发表的学术论文36-37
• 致谢37

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