毛囊源性iPS细胞经定行内胚层诱导为肝细胞样细胞的研究

发布时间：2017-07-08 12:12

  本文关键词：毛囊源性iPS细胞经定行内胚层诱导为肝细胞样细胞的研究

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【摘要】：背景众所周知,i PS细胞具有与ES细胞相似的形态、基因表型及多向分化、自我更新能力,并且回避了ES细胞所面临的伦理学的困扰。目前已有文献报道有关i PS细胞肝向诱导的成功案例,但是仍有许多问题亟待解决。首先,靶细胞的选择是至关重要的。国内、外实验室使用的i PS细胞的重编程靶细胞为:皮肤成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、脂肪干细胞、脐带血来源CD34+细胞和脐带间充质干细胞等,其中最常见的是皮肤成纤维细胞。本实验室创新性地重编程毛囊间充质干细胞为i PS细胞,建立了毛囊源性i PS细胞系,具有取材广泛、安全、简便、无创等优点。其次,传统的诱导方法是通过拟胚体(EB)阶段进行i PS细胞的肝向诱导。拟胚体途径的主要目的是模拟体内的胚胎发育过程,拟胚体中的三胚层细胞可以互相支持、互相提供细胞生长分化所必需的微环境。但是,由于拟胚体的特殊三维立体结构,其分化后的细胞处于不同的分化阶段,限制了所得成体细胞临床应用的可能性;拟胚体不仅可以分化为肝细胞,亦可分化为胰腺细胞,降低了细胞的纯度;经由拟胚体得到的细胞寿命较短。因此,我们必须探索出一个新的诱导途径,以达到i PS细胞高效肝向诱导的目的。本实验绕过拟胚体阶段,经由定行内胚层阶段,模拟体内肝细胞的生长发育模式,促使i PS细胞向肝细胞样细胞方向分化。本方案显著提高了i PS细胞体外肝向诱导的效率、细胞的寿命及细胞的数量。最后,目前已有的诱导方法仍存在效率较低这个致命的问题,因此我们在诱导方法上进行了优化改良。我们将HGF应用于i PS细胞的肝向诱导中,在诱导的早期,加入了大剂量的HGF,从而有效地促进了定行内胚层形成,遵循了高效性的原则。方法本实验选择毛囊源性i PS细胞为实验对象,对其进行体外诱导,绕过拟胚体阶段,经过定行内胚层向肝细胞样细胞分化,并对所得细胞进行鉴定。本实验具有以下几个优点:(1)本实验室重编程毛囊间充质干细胞,构建了新的毛囊源性i PS细胞系,细胞的来源更加丰富,且取材更加安全、无创、简便;(2)与传统诱导方法相比,我们绕过了拟胚体阶段,经定行内胚层进行i PS细胞的肝向诱导,提高了细胞的纯度与寿命,确保实验的有效性、高效性;(3)我们在诱导的初期使用了大剂量的HGF,从而促进了i PS细胞向定行胚层(DE)的诱导分化,增加了DE形成的比例。结果本实验选用毛囊源性i PS细胞为对象,相差显微镜观察其细胞呈克隆样排列;RT-PCR证实其不表达DE、HLCs的特异性标记基因。经过4天诱导后的定行内胚层细胞,相差显微镜观察其细胞连接断裂,细胞体积变大;RT-PCR证实有DE的特异性标记基因SOX17、FOXa2的表达;免疫荧光染色提示其在蛋白水平上有SOX17的表达。我们得到的HLCs经相差显微镜观察可知其细胞体积较大,呈多角形,细胞核呈圆形;RT-PCR证实具有肝细胞特异性标记基因ALB,AFP,HNF4α,AAT,CYP3A4和CK18的表达;免疫荧光染色表明其在蛋白水平上表达ALB,AFP,CYP3A4和CYP7A1;功能鉴定提示HLCs具有糖原贮存、LDL摄取和ICG摄入和排泄功能。结论本实验选择毛囊源性i PS细胞为靶细胞,取材安全无创。在诱导方法上,我们首先选择了经定行内胚层进行诱导,避免了拟胚体阶段,从而提高了细胞寿命和诱导效率,其次,我们在诱导的初期加入大剂量的HGF,大大促进了定行内胚层的形成,从而保证i PS细胞能够迅速、有效的向肝细胞样细胞诱导分化。通过我们的方法,可以大量地生产i PS源性肝细胞样细胞,为广大的肝衰病人带来福音和生命的希望。
【关键词】：干细胞 iPS细胞 定行内胚层 肝细胞样细胞 细胞治疗
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文缩略词表8-13
• 第1章 引言13-24
• 1.1 iPS细胞的发现13-15
• 1.2 iPS细胞的分化潜能15-16
• 1.3 肝脏疾病细胞治疗的现状16-18
• 1.4 iPS细胞在肝脏疾病中的应用潜能18-19
• 1.5 iPS细胞向肝细胞定向分化的诱导方案19-22
• 1.5.1 iPS细胞向定行内胚层细胞分化20-21
• 1.5.2 iPS细胞肝向分化21
• 1.5.3 iPS源性肝细胞功能的成熟21-22
• 1.5.4 iPS源性肝细胞样细胞的特征及功能评估22
• 1.6 研究前景与面临问题22-24
• 第2章 材料与方法24-35
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 主要仪器和设备24-25
• 2.1.2 主要试剂25-26
• 2.2 实验方法26-35
• 2.2.1 iPS细胞的复苏26-27
• 2.2.2 挑取克隆27
• 2.2.3 铺制饲养层27-28
• 2.2.4 iPS细胞的传代28-29
• 2.2.5 iPS细胞的冻存29
• 2.2.6 iPS细胞体外诱导29-31
• 2.2.7 聚合酶链式反应（PCR）31-32
• 2.2.8 免疫荧光染色32-33
• 2.2.9 糖原染色（PAS染色）33
• 2.2.10 LDL摄取实验33-34
• 2.2.11 ICG摄取与排泄实验34-35
• 第3章 实验结果35-46
• 3.1 毛囊源性iPS细胞经定行内胚层向肝细胞样细胞的诱导35
• 3.2 定行内胚层的形成35-36
• 3.3 定行内胚层特异基因表达36-37
• 3.4 定行内胚层蛋白水平表达情况37-39
• 3.5 定行内胚层向肝细胞样细胞(HLCS)的诱导39
• 3.6 肝细胞样细胞(HLCS)的特异性基因39-40
• 3.7 HLCS的蛋白水平表达情况40-43
• 3.8 HLCS的功能学鉴定43-46
• 3.8.1 HLCs的糖原合成与贮存功能43-44
• 3.8.2 HLCs的LDL摄取能力44-45
• 3.8.3 HLCs的ICG摄取与排泄能力45-46
• 第4章 讨论46-49
• 4.1 体外诱导靶细胞的选择46-47
• 4.2 定行内胚层的优势47
• 4.3 诱导方法的优化与改良47-49
• 第5章 结论49-50
• 参考文献50-56
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果56-57
• 致谢57

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