心理应激促进DSS诱导小鼠结肠炎症反应的机制研究

发布时间：2017-08-04 03:10

  本文关键词：心理应激促进DSS诱导小鼠结肠炎症反应的机制研究

  更多相关文章： 心理应激 结肠炎 儿茶酚胺 肾上腺素能受体 中性粒细胞

【摘要】：炎症性肠病(inflammatory bowel disease IBD)是一类以胃肠道慢性炎症和粘膜组织损伤为病理特征的疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis UC)和克罗恩病(Crohn’s disease CD),临床表现为腹泻、腹痛和血便,病情常反复发作、迁延不愈,主要发生于欧美国家。近年来,IBD在亚洲和南美洲的患病率亦日益升高。IBD的病因主要与遗传、环境、免疫等因素有关,但肠道慢性炎症反复发作的机制尚不清楚。部分观点认为,肠道慢性炎症的发生与肠道粘膜免疫缺陷有关。然而,近年来的研究发现提示,心理应激可影响肠道免疫功能,因而与特发性炎症性肠道疾病的病理生理机制密切相关。应激反应(stress)是机体应对周围环境变化而产生的主动或被动的非特异性反应,包括心理与生理反应。当受到各种应激源(例如冷热、创伤、感染、手术、焦虑、抑郁等)刺激时,机体的应激反应系统[交感神经系统和下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)]被激活,交感神经元和肾上腺髓质释放儿茶酚胺[如肾上腺素(epinephrine,EPI)和去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)],肾上腺皮质释放皮质醇。应激导致的多种神经递质(如儿茶酚胺和血管活性肠肽)的过度释放,可激活表达于淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞表面的肾上腺素能受体(adrenergic receptor,AR),调节免疫细胞中细胞因子和抗体的产生,从而影响局部炎症反应的进程。本研究利用葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)诱导的小鼠结肠炎模型,探讨了慢性心理应激对DSS诱导的小鼠结肠炎症的影响,研究了应激相关的信号通路激活促进结肠炎症反应和组织损伤的机制。主要的研究结果如下:1.心理应激加重DSS诱导的结肠炎症及促进结肠组织中性粒细胞浸润为探索心理应激对IBD进程的影响,我们建立了经典的DSS诱导的小鼠结肠炎模型,采用慢性束缚应激(chronic restraint stress,CRS)和慢性不可预见性应激(chronic unpredictable stress,CUS)刺激小鼠。我们的研究结果显示,CRS和CUS显著加重了模型小鼠的肠道炎症,促进了结肠组织中的炎性细胞浸润及粘膜上皮的损伤,严重破坏了结肠粘膜的屏障功能,加速了模型小鼠的死亡。进一步的机制研究发现,CUS可促进结肠组织中促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-22)异常表达,导致STAT3炎症信号通路过度激活、中性粒细胞趋化因子(CXCL-1、CXCL-2)表达水平及外周血中性粒细胞比例明显升高、结肠组织中性粒细胞广泛浸润。2.CUS激活的肾上腺素能信号在促进DSS诱导的小鼠结肠炎症中发挥关键作用为了探索应激相关的信号通路在dss诱导的小鼠结肠炎症中的作用,我们采用β-ar激动剂异丙肾上腺素(isoproterenol,iso)处理小鼠,以模拟慢性心理应激对模型动物的影响。我们的研究结果显示,iso刺激对dss诱导的小鼠产生了与慢性心理应激相似的效应。与dss单独处理组的小鼠相比,dss+iso诱导的小鼠结肠组织损伤更严重,结肠缩短更明显,外周血中性粒细胞比例升高更显著,结肠组织中促炎细胞因子和趋化因子的表达水平更高,肠粘膜固有层中性粒细胞浸润程度更重。β-ar阻断剂普萘洛尔可有效抑制由cus引起的炎性因子异常表达及stat3磷酸化。在细胞体外培养实验中,用ne刺激ht29细胞可促进cxcl-1和cxcl-2表达和stat3磷酸化。中性粒细胞趋化实验结果表明,ne刺激ht29细胞,可有效地促进transwell小室上层的中性粒细胞向下层的ht29细胞趋化。我们还发现,儿茶酚胺生物合成的限速酶酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,th)在dss+cus组小鼠结肠肌层神经纤维和神经节中的表达显著升高,表明慢性心理应激增强了肾上腺素能神经系统的活动,提示hpa轴和交感神经系统与免疫系统之间的相互作用在ibd病程中发挥了重要的作用。3.儿茶酚胺和il-17a协同激活stat3信号通路促进中性粒细胞浸润我们发现,应激反应可增加结肠组织中il-17a和il-22的表达。当我们用il-17a和ne共同刺激ht29细胞时,stat3磷酸化程度较ne或il-17a单独刺激更加明显。用ne或iso联合il-17a刺激ht29或ct26细胞时,可见cxcl-1和cxcl-2表达显著升高,且明显高于ne或iso单独刺激的效应。中性粒细胞趋化实验结果显示,单独使用ne和il-17a刺激均可产生较强的中性粒细胞趋化效应;当采用ne和il-17a联合刺激细胞时,可进一步促进中性粒细胞的趋化作用。这些结果提示,在dss诱导的小鼠结肠炎症过程中,儿茶酚胺和il-17a可协同调控中性粒细胞趋化因子的表达,促进中性粒细胞浸润至结肠炎症部位。4.心理应激通过激活β1-ar/β2-ar介导的信号增强dss诱导的炎症反应我们采用了不同的β-ar抑制剂,探索了心理应激增强dss诱导的肠道炎症的信号机制。我们发现,β3-ar特异性阻断剂sr59230a对慢性心理应激引起的肠道中性粒细胞浸润和结肠组织损伤无明显的抑制作用。然而,β1-ar/β2-ar抑制剂普萘洛尔则可显著降低模型小鼠外周血中性粒细胞的比例,减少结肠组织中中性粒细胞的浸润,并对结肠组织炎症反应和组织损伤有明显的改善作用,提示β1-ar/β2-ar介导的信号通路激活与dss+cus诱导的中性粒细胞浸润密切相关。普萘洛尔亦可抑制cus诱导的促炎细胞因子和中性粒细胞趋化因子的表达上调及stat3信号通路的过度活化,表明慢性心理应激主要通过活化β1-ar/β2-AR信号通路促进肠道的炎症反应及组织损伤。综上所述,本研究揭示了慢性心理应激促进DSS诱导的小鼠结肠炎症反应的一个潜在的重要机制:慢性心理应激导致儿茶酚胺过度释放,通过激活β肾上腺素能信号,上调促炎细胞因子和中性粒细胞趋化因子的表达,促进中性粒细胞动员、招募及浸润至结肠炎症部位,加重结肠炎症反应。我们认为,应激相关信号的激活可能降低结肠炎症反应的触发阈值,诱导结肠炎症的反复发作,导致结肠粘膜及其功能的严重损害。我们的研究结果为探索心理应激与IBD的病理生理机制的关系提供了新的思路,亦提示调控神经信号的药物可能具有预防及治疗IBD的潜在应用价值。
【关键词】：心理应激 结肠炎 儿茶酚胺 肾上腺素能受体 中性粒细胞
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R574.62
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 材料与方法15-27
• （一）材料15-17
• 1 动物15
• 2 细胞株15
• 3 试剂15-16
• 4 抗体16-17
• 5 其他试剂17
• 6 主要仪器17
• 7 其他器材17
• （二）实验方法17-27
• 1 动物实验17-19
• 2 细胞培养19
• 3 Western blot19-20
• 4 实时定量PCR20-23
• 4.1 RNA提取20-21
• 4.2 反转录21
• 4.3 实时定量PCR21-23
• 5 组织病理23
• 6 免疫组化23-24
• 7 流式细胞术24
• 8 小鼠肠道菌群移位的检测24-25
• 9 中性粒细胞趋化实验25
• 10 ELISA25-26
• 11 数据分析26-27
• 结果27-57
• （一）心理应激加重DSS诱导的小鼠结肠炎症27-32
• （二）心理应激促进DSS诱导的小鼠结肠中性粒细胞浸润32-36
• （三）心理应激增强DSS诱导的炎性信号通路活化36-40
• （四）儿茶酚胺在心理应激诱导的中性粒细胞浸润中发挥重要作用40-46
• （五）儿茶酚胺增强IL-17A诱导的中性粒细胞浸润46-48
• （六）心理应激通过激活 β1-AR/β2-AR促进DSS诱导的小鼠结肠炎症反应48-57
• 讨论57-59
• 参考文献59-63
• 硕士期间发表的学术论文63-64
• 个人简历64-65
• 致谢65

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本文编号：617471