人胆囊炎致病菌对豚鼠肠道屏障及其结构蛋白的影响

发布时间：2017-08-13 06:30

  本文关键词：人胆囊炎致病菌对豚鼠肠道屏障及其结构蛋白的影响

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【摘要】：现代生活中,随着人类饮食结构和生活方式的改变,近年来胆囊炎的发病率有增高的趋势。对于胆囊炎的发病机制有多种假说,细菌感染为其假说之一。本课题组前期工作中,通过检测临床样本,发现胆囊炎患者的胆汁中有细菌存在,并分离鉴定出一株感染性大肠杆菌Enteroinvasive Escherichia Coli(EIEC)。动物实验证实,口服该菌能够使豚鼠产生胆囊炎。这些证据提示该菌为人类胆囊炎的致病菌。本课题旨在揭示该致病菌如何穿透肠道屏障入血的机制,为最终阐明细菌性胆囊炎发病的分子机制提供理论依据。本课题模拟抗生素导致肠道屏障受损状态,并通过PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术来鉴定该状态的存在,然后分组处理模式动物,一组用鼠李糖乳酸杆菌灌胃,作为阳性对照;另一组用本实验室特有菌种E.coli O124 K72灌胃。最后通过PCR-DGGE电泳结果来观察肠道菌群变化,并通过HE染色切片来观察肠道形态学改变。研究表明,肠道病原菌可以通过改变肠道紧密连接蛋白的屏障结构与功能,使其有利于细菌的入侵和感染,从而具有操纵宿主的功能。本课题通过免疫组化来分析肠道紧密连接蛋白的表达情况,并检测肝中,血中是否含有该致病菌,探究该致病菌是否通过消耗肠道粘液为碳源,从而突破肠道屏障入血?还是该致病菌将肠道屏障破坏,从而引起其他细菌大量入血入肝,最后入胆引起胆囊炎?目的本课题旨在揭示该致病菌如何穿透肠道屏障入血的机制,为最终阐明细菌性胆囊炎发病的分子机制提供理论依据。通过模拟抗生素导致肠道屏障受损状态,并由PCR-DGGE技术来鉴定该状态的存在,然后分组处理模式动物,一组用鼠李糖乳酸杆菌灌胃,另一组用本实验室特有菌种E.coli O124 K72灌胃。最后通过PCR-DGGE电泳结果来观察肠道菌群变化,并通过HE染色切片来观察肠道的形态学改变。通过免疫组化来分析肠道紧密连接蛋白的表达情况,并检测肝中,血中是否含有该致病菌,探究该致病菌是否通过消耗肠道粘液为碳源,从而突破肠道屏障入血?还是该致病菌将肠道屏障破坏,从而引起其他细菌大量入血入肝,最后入胆引起胆囊炎?方法1、采用抗生素给动物灌胃,以提高感染性大肠杆菌的感染效果。抗生素左氧氟沙星按照规定计量给两组豚鼠灌胃10天,分别在不同天数收集豚鼠粪便。并用试剂盒对粪便总DNA进行提取。然后利用PCR-DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,变性梯度凝胶电泳)对上述粪便DNA进行分离分析,观察其多样性的变化,以及整体趋势,确定肠道菌群失衡。并选择感兴趣的条带进行切胶回收,构建克隆载体,鉴定菌种等。2、通过灌胃方式将从急性胆囊炎患者胆汁中分离获得的致病菌接种到豚鼠体内,并通过特异性引物检测豚鼠血清中是否含有该致病菌,肝脏组织研磨液中是否含有该致病菌。3、通过病理切片观察其对豚鼠肠道形态结构的影响,以确定损伤。利用IHC技术来检测肠道上皮细胞封闭蛋白Occludin和紧密连接蛋白Claudin 2的表达情况,对比各组之间的变化,来研究豚鼠的肠屏障功能是否遭到破坏。探索该致病菌是通过哪些途径对胆道系统造成影响的。4、利用real-time PCR在m RNA水平检测不同处理组间,肠道粘液分泌相关蛋白的基因表达情况,探讨肠道屏蔽损伤机制。结果1.PCR-DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,变性梯度凝胶电泳),结果显示,抗生素处理不同天数肠道菌群多样性呈递减趋势。2.测序结果显示抗生素处理过后,益生菌种类减少,致病菌种类增加,其中Bifidobacterium magnum(双歧杆菌)在抗生素处理三天后显著减少;Desulfotomaculum thermocisternum(脱硫肠状菌属)的菌量随着抗生素处理天数的增加呈现递减趋势;Streptococcus constellatus(星座链球菌)在正常组没有,随着抗生素给药天数增加,该菌逐渐出现。此外还检测出Desul Fovibrio(脱硫弧菌),Hyphomonas neptunium(生丝单胞菌属),Tetragenococcus halophilus subsp.Halophilus(嗜盐四联球菌)等。3.Real-time PCR结果显示.Anti+E.coli组,粘液分泌相关蛋白Muc13,Muc15,Muc1,基因表达水平较正常组和益生菌组显著增加。4.E.coli O124 K72侵染豚鼠实验的结果显示,大肠杆菌灌胃组(Anti+E.coli),其病理切片显示结肠壁内大量空泡组织,显示高脚杯细胞增生,并伴有轻度炎症。5.免疫组化显示益生菌组(Anti+LGG)Claudin-2含量较正常对照组(CG.)有所增加,但无统计学意义;而Anti+E.coli组Claudin-2含量较正常组显著增加(P0.05)。Occludin表达量与上一组结果正好相反。6.将各组肝脏组织研磨液进行培养,并设计E.coli O124 K72的特意性引物,对菌液进行特异性扩增,但并未检测出肝脏中有该致病菌存在,同理血清中也没有该致病菌,但是益生菌组的肝脏研磨液中发现一种益生菌存在,Bacillus toyonensis。结论:1、本课题采用PCR-DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,变性梯度凝胶电泳)对抗生素处理过的模式动物粪便细菌总DNA进行定性、半定量分析,观察肠道菌群整体变化趋势。比较抗生素处理过和正常组肠道菌群组成的差异,系统全面的揭示抗生素对肠道菌群的破坏,确定造模成功。2、Real-time PCR结果显示.Anti+E.coli组,粘液分泌相关蛋白Muc13,Muc15,Muc1基因表达水平较正常组和益生菌组显著增加。说明肠道长期遭受致病菌侵袭,不但其结构会发生改变,基因水平上也会有变化,而且这几种粘液分泌蛋白表达增高,也说明肠道的一种炎症症状,大量分泌粘液,是肠道对抗外界刺激的一种自我保护。3、免疫组化的结果显示,E.coli(O124 K72)接种到豚鼠体内,肠粘膜结构发生变化,并上调Claudin 2的表达,下调Occludin的表达使肠道屏障功能和遭到破坏有关。
【关键词】：抗生素 肠道菌群 PCR-DGGE 致病性大肠杆菌 益生菌 Claudin 2 Occludin
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.61
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-15
• 材料和方法15-39
• 1. 材料15-16
• 1.1 动物与菌种15
• 1.2 要主仪器15
• 1.3 主要试剂15
• 1.4 主要试剂的配置15-16
• 2. 实验方法16-28
• 2.1 动物模型的制备16
• 2.2 粪便样品DNA提取16-22
• 2.3 石蜡切片及HE染色22-24
• 2.4 免疫组化检测肠道紧密连接蛋白（Claudin 2 和Occludin）表达的变化24-25
• 2.5 结肠组织RNA的提取(Trizol研磨法)25-26
• 2.6 实时定量PCR（Real-time PCR）检测结肠分泌蛋白MUC家族基因的表达26-27
• 2.7 肝脏组织和血清细菌培养27-28
• 结果28-37
• 讨论37-38
• 参考文献38-39
• 综述 肠道菌群紊乱与肠道屏障功能的关系39-50
• 1. 结肠黏膜屏障之粘蛋白40-43
• 1.1 粘蛋白MUC140-41
• 1.2 粘蛋白MUC1341-42
• 1.3 粘蛋白MUC1542-43
• 2. 结肠屏障之紧密连接蛋白43-45
• 2.1 紧密连接蛋白CLDN243-44
• 2.2 跨膜蛋白Occludin44-45
• 参考文献45-50
• 致谢50-51

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本文编号：665869