MiR34a调节HBV复制和对肝癌细胞生长的影响及其机制研究

发布时间：2017-08-25 04:01

  本文关键词：MiR34a调节HBV复制和对肝癌细胞生长的影响及其机制研究

  更多相关文章： MiR-34a HBV复制 HNF4α 肝癌 增殖 SOX4

【摘要】：MicroRNAs (miRNAs)是一类非编码小RNA,能在转录后水平上通过降解mRNA或抑制蛋白翻译而调节许多靶基因的表达。这些miRNAs参与了包括细胞发育,凋亡,增殖和分化在内的许多细胞学和生理学过程。肝细胞癌是第六大最常见恶性肿瘤,乙肝或丙肝病毒感染导致的慢性肝病是导致肝癌的主要诱发因素。但是目前对肝癌病人的治疗策略很有限,迫切需要我们去分析肝癌发病的致病机制,来寻找系统有效治疗的新靶标和发现新的早期诊断标志物。许多研究发现,miRNAs参与了乙肝病毒的复制与表达,在病毒与宿主的相互作用中起着关键作用。异常表达的miRNAs也能通过靶向调节与癌症相关信号通路的基因,而作为致癌或抑癌基因参与到肝癌的发病或发展中。异常表达的miRNAs在病毒与宿主互作和肝癌发展中的作用暗示,miRNAs可能成为治疗的靶标或治疗工具。本文的第一部分,我们利用构建的miRNA表达载体库在细胞瞬时转染模型中进行HBV复制相关miRNA分子的筛选,并选择其中具有代表性的niRNA分子进行抗HBV复制的分子机制研究。首先使用具有HBV低水平复制的肝癌细胞系HepG2.2.15作为筛选模型,从我们构建的miRNA表达库中筛选与HBV复制有潜在关联的miRNA。对细胞培养上清HBsAg蛋白表达检测结果发现有5种miRNAs与HBV的HBsAg蛋白表达相关：miR-let-7g, miR-101, miR-345促进了HBsAg的表达,而miR-34a和miR-92b抑制了HBsAg的表达。我们继续在瞬转HBV表达载体的HepG2细胞中检测这5中miRNAs对HBsAg/HbeAg的影响。结果显示miR-34a仍能够显著抑制HBsAg/HBeAg的表达,而其他miRNAs却没有明显效果。通过定量PCR检测,miR-34a在大部分肝癌组织中为低表达水平。所以我们选择miR-34a作为候选基因,研究其在HBV复制中作用及调节机制。我们在HepG2.2.15细胞中检测了miR-34a对上清HBsAg/HBeAg、HBV DNA和HBV细胞内HBV RNA、复制中间体、HBCAg蛋白表达的影响。结果表明,过表达miR-34a显著抑制HBV的复制与表达；而抑制miR-34a表达水平能明显促进HBV的复制与表达。我们进一步研究niR-34a对HBV复制与表达的分子机制研究。通过HBV序列分析,末找到miR-34a的直接靶标；排除了miR-34a直接作用于HBV转录子可能。我们推测,miR-34a有可能通过调节与HBV复制相关的肝转录因子,使用分析软件发现,在对miR-34a预测的靶基因中包含一些重要的与HBV复制相关的肝转录因子,包括HNF1A、FOXA1、HNF4A, HNF4G等。我们使用荧光素酶报告基因检测验证niR-34a对靶基因的作用,结果显示miR-34a表达能降低HNF4A和HNF4G的3'UTR荧光素酶活性。过表达miR-34a能抑制HNF4A mRNA和蛋白的表达。通过定量PCR检测发现,肝癌组织HNF4A表达与miR-34a表达呈负相关。我们也研究了niR-34a对HBV启动子和增强子的影响,我们把所有的HBV启动子克隆到报告基因载体上,并与miR-34a共转染到细胞,荧光素酶报告检测表明,miR-34a的过表达抑制HBV启动子PreS1、PreS2/S和增强子II的活性,这与HNF 4A对HBV的作用一致。以上的结果证明：HNF4A是miR-34a抑制HBV复制与表达的调解者。本文的第二部分,为了研究miR-34a在肝癌中生物学功能,我们在HepG2和Bel7404细胞中分别对miR-34a进行过表达和低表达的研究,采用MTT、细胞转移和侵袭实验和划痕愈合实验方法检测miR-34a对肝癌细胞系转移和增殖的影响。结果表明,miR-34a在肝癌细胞中表达水平与迁移侵袭能正相关；在肝癌细胞中过表达miR-34a显著抑制细胞的增殖和转移,而且miR-34a过表达还能抑制肝癌增殖能力,减缓了细胞周期G1-S的转变。接下来,我们对miR-34a肝癌细胞的调节机制进行了初步研究,使用miRNA预测软件预测发现致癌基因SOX4是miR-34a潜在的靶标,通过使用报告基因检测到SOX4的3'UTR的荧光素酶活性受到miR-34a的显著抑制,所以作为已经在卵巢癌中被报道能促进细胞增殖和转移的致癌基因SOX4是miR-34a的靶基因。SOX4的过表达能部分去除miR-34a对肝癌细胞的转移和增殖的抑制水平。另外,在,niR-34a低表达的细胞中β-catenin蛋白表达上调,并且SOX4的高表达显著增强了β-catenin的表达,这些结果这说明miR-34a的低表达可能通过上调SOX4及激活Wnt/p-catenin信号通路,最终促进细胞的增殖。
【关键词】：MiR-34a HBV复制 HNF4α 肝癌 增殖 SOX4
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7;R512.62
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 引言12-15
• 第一部分 MIR-34A对HBV的复制和表达的影响研究15-61
• 1 前言15-17
• 2 材料和方法17-39
• 3 结果39-58
• 4 讨论58-61
• 第二部分 MIR-34A对肝癌细胞转移和增殖的影响研究61-85
• 1 前言61-62
• 2 材料与方法62-71
• 3 结果71-82
• 4 讨论82-85
• 结论85-87
• 参考文献87-96
• 附录96-100
• 综述100-121
• 参考文献112-121
• 作者简历及博士在读期间所取得的科研成果121

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本文编号：734915