CD36棕榈酰化修饰在肝细胞凋亡中的分子机制研究

发布时间：2017-08-29 22:05

  本文关键词：CD36棕榈酰化修饰在肝细胞凋亡中的分子机制研究

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【摘要】：目的:随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变,非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已经成为严重影响人类健康的常见病,有1/3的病人会发展为相对凶险的非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH),但其发病机制尚不完全清楚且缺乏有效的临床治疗。大量的临床数据和动物实验证明,肝细胞凋亡可以进一步促进炎症、纤维化、硬化等反应,在NASH发生中有重要作用。CD36又称为脂肪酸转位酶(Fatty acid translocase,FAT)是清道夫受体B型成员,CD36缺失或者过表达都会引发NASH。棕榈酰化修饰是蛋白翻译后修饰的一种,有研究报道蛋白的棕榈酰化修饰会影响细胞凋亡。CD36也可进行棕榈酰化修饰,然而CD36棕榈酰化与细胞凋亡的关系却无人报道。因此本文旨在探讨CD36棕榈酰化修饰是否参与了肝细胞凋亡导致NASH的发生,并对其中机制作初步探讨。方法:第一部分:以C57BL/6J雄性小鼠为实验动物,给予正常饮食(Nornal chow diet,NCD)和高脂饮食(High fat diet,HFD)喂养22周,建立NASH动物模型。HE染色观察形态学,油红O染色观察脂质积聚情况,检测小鼠血清中谷丙转氨酶(alanineaminotransferase,alt)和谷草转氨酶(aspertateaminotransferase,ast)含量。体外模型中,hepg2给予棕榈酸(palmitateacid,pa)处理,油红o观察脂质积聚情况。在体内外模型中,用酰基-生物素置换法(acyl-biotinylexchange,abe)方法检测cd36棕榈酰化修饰水平。westernblot用来检测肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,tnf-α)的表达和junn-terminalkinase(jnk)的磷酸化,用tunel染色和caspase-3活性检测细胞凋亡,适时荧光定量pcr(rt-pcr)检测凋亡基因bax,bcl-2的表达。第二部分:选择c57bl/6j小鼠,通过尾静脉注射慢病毒,使小鼠高表达野生型cd36(wt-cd36)或棕榈酰化位点突变型cd36(aa-ss),并全程给予高脂喂养8周,构建体内模型。在hepg2细胞中,转染慢病毒,使hepg2稳定高表达野生型cd36(wt-cd36)或棕榈酰化位点突变型cd36(aa-ss),建立稳定细胞系。另采用蛋白棕榈酰化抑制剂2-溴软脂酸乙烯(2-bromopalmitate,2-bp)处理hepg2完成体外实验。用abe方法检测cd36棕榈酰化修饰水平;进行he、油红o染色和小鼠血清中alt和ast含量测定;用tunel染色及caspase-3检测反应凋亡情况;用rt-pcr检测凋亡基因bax、bcl-2的表达。第三部分:利用第二部分的动物和细胞模型,用westernblot检测体内外tnf-α表达及jnk磷酸化水平;利用免疫共沉淀的方法检测cd36和tlr4共聚体的形成;用去垢剂抵抗(detergent-resistantmembranes,drms)的方法分离提取脂筏,并观察cd36在脂筏的分布。结果:第一部分:HE和油红O染色发现HFD小鼠肝脏脂肪样变性、脂质积聚和炎症细胞浸润明显高于NCD小鼠,而且Western blot显示TNF-α表达和JNK信号通路磷酸化水平增加同时伴有CD36棕榈酰化水平增加,TUNEL阳性细胞增多,Bax表达增加,Bcl-2表达下降,Caspase-3活性增加,血清中ALT和AST明显增加(P0.05),HFD小鼠肝脏明显受损,小鼠肝脏CD36棕榈酰化水平明显增加(P0.05)。第二部分:HE和油红O染色提示AA-SS小鼠肝脏病变较wt-CD36有所减轻,血清中ALT和AST水平下降,TUNEL阳性细胞减少,Caspase-3活性降低,Bcl-2表达明显增加。体外实验采用突变或抑制剂处理都可以降低CD36棕榈酰化修饰水平,降低凋亡caspase-3活性,促进Bcl-2表达增加(P0.05)。第三部分:Western blot、免疫共沉淀和脂筏的结果显示,体内外实验中,采用突变(AA-SS)或者抑制剂(2BP)处理均可降低TNF-α表达及JNK磷酸化水平,且CD36和TLR4形成共聚体减少,CD36在脂筏的分布比例降低,与对照组相比有统计学意义(P0.05)。结论:1.高脂饮食可以导致NASH的发生,增加小鼠肝细胞凋亡及CD36棕榈酰化修饰水平;2.抑制CD36棕榈酰化能够减少CD36在脂筏中的分布,与TLR4形成共聚体减少,引起TNF-α减少JNK磷酸化降低,从而降低细胞凋亡,改善NASH。
【关键词】：CD36 棕榈酰化 凋亡 炎症 NASH
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一部分 高脂促进肝细胞凋亡及肝损伤伴有CD36棕榈酰化修饰程度增加15-37
• 第一章 非酒精性脂肪性肝炎体内外模型的构建及鉴定15-25
• 1.材料和方法15-23
• 2.实验结果23-25
• 第二章 高脂对细胞凋亡及CD36棕榈酰化修饰程度的影响25-34
• 1.材料和方法25-32
• 2.实验结果32-34
• 讨论34-37
• 第二部分 抑制CD36棕榈酰化修饰改善细胞凋亡及肝损伤37-49
• 第一章 稳定表达野生型及棕榈酰化突变型CD36体内外模型的构建及鉴定37-42
• 1.材料和方法37-39
• 2.实验结果39-42
• 第二章 抑制CD36棕榈酰化修饰对细胞凋亡及肝损伤的影响42-47
• 1.材料和方法42-43
• 2.实验结果43-47
• 讨论47-49
• 第三部分 抑制CD36棕榈酰化改善细胞凋亡和肝损伤的分子机制探讨制49-61
• 第一章 抑制CD36棕榈酰化对体内外炎症反应的影响49-52
• 1.材料和方法49-50
• 2.实验结果50-52
• 第二章 抑制CD36棕榈酰化对CD36在脂筏分布的影响52-56
• 1.材料和方法52-54
• 2.实验结果54-56
• 第三章 抑制CD36棕榈酰化对CD36与TLR4形成共聚体的影响56-58
• 1.材料和方法56-57
• 2.实验结果57-58
• 讨论58-61
• 全文总结61-62
• 参考文献62-68
• 文献综述68-75
• 参考文献71-75
• 致谢75-76
• 攻读学位期间发表的学术论文76-77
• 攻读硕士研究生期间参加的学术会议77

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本文编号：755660