EPAC对乙醛诱导的大鼠肝星状细胞增殖和激活的作用

发布时间：2017-09-18 18:28

  本文关键词：EPAC对乙醛诱导的大鼠肝星状细胞增殖和激活的作用

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【摘要】：酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于长期大量饮酒而导致的肝脏损害性病变。酒精性肝纤维化(alcoholic liver fibrosis, ALF)是ALD进展为酒精性肝硬化或肝癌的中间阶段和必经病理过程。在ALF的发生过程中,乙醇可通过其直接代谢产物乙醛激活肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),活化的HSC是肝纤维化过程中细胞外基质(Extra cellular matrix,ECM)的主要来源,也是各种因素所致肝纤维化发生的核心和关键环节。cAMP信号通路是细胞内非常重要的信号传递途径之一,最初认为蛋白激酶A(PKA)是其唯一的下游效应因子。cAMP/PKA通过磷酸化cAMP反应序列结合蛋白(CREB)的Ser-133位点使之活化,然后作用于cAMP反应序列影响基因表达,进而调控细胞的生长、分化。课题组前期研究已经探讨了cAMP/PKA/CREB信号通路在大鼠酒精性肝纤维化模型和乙醛刺激的大鼠肝星状细胞中的作用。EPAC(exchange protein directly activated by cAMP)是一种由cAMP激活的鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs),又称为cAMP-GEF,是1998年de Rooij等新发现的独立于PKA的cAMP下游效应因子,在许多重要的细胞生理病理进程中都发挥重要的调控作用。这提示了cAMP细胞中的效应可能不只是由以前鉴定的靶蛋白所介导。cAMP通过EPAC活化Rapl, Rapl是Ras样的小分子G蛋白,通过与EPAC结合而被活化,EPAC能增加这类小分子G蛋白对GTP的摄取并使之形成有活性的GTP结合构象。目前为止已发现了两种EPAC亚型：EPAC1 (RapGEF3)和EPAC2 (RapGEF4),由不同的基因编码。那么,EPAC基因是否在大鼠肝星状细胞中表达呢?如果表达又起到什么样的作用呢?是否和PKA作用相同?因此,本课题的研究内容是在采用乙醛诱导HSC-T6细胞建立离体大鼠酒精性肝纤维化HSC模型的基础上,运用RNA干扰技术和EPAC激动剂,观察EPAC1和EPAC2的表达对α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达的影响,为酒精性肝纤维化的防治提供新的靶点。主要内容概括如下：1.EPAC在大鼠肝星状细胞中的表达情况实验采用大鼠HSC-T6细胞系为研究对象,用浓度为200μM乙醛处理细胞48 h,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、Western blot分别检测EPAC1和EPAC2的mRNA与蛋白的表达水平。结果显示,EPAC1和EPAC2在正常HSC均有表达,与正常组比较,经200μM乙醛作用48 h后,HSC模型组EPAC2表达水平明显增高,而EPAC1表达水平显著下降。提示EPAC1和EPAC2在乙醛诱导的HSC中可能起到不同的作用。2. EPAC对乙醛刺激的HSC—T6增殖和激活的作用实验设正常对照组(常规培养), 模型组,EPAC激动剂(8-(4-Chlorophenylthio)-2'-O-methyladenosine 3',5'-cyclic monophosphate monosodium hydrate, Me-cAMP)组。除正常对照组外其余各组均以200μM乙醛作用48 h,制备大鼠酒精性肝纤维化HSC模型。Me-cAMP组在乙醛作用24 h后再加入Me-cAMP继续共同作用24 h。利用MTT法检测Me-cAMP对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测Me-cAMP对细胞周期的影响。qRT-PCR及Westernblot法分别检测HSC-T6的α-SMA、Ⅰ型和III胶原mRNA和蛋白表达以及Rapl的蛋白表达。与模型组比较,Me-cAMP明显增加了EPAC1和2的表达,使EPAC1的表达升高了约三倍,并且使细胞增殖活力明显下降。流式细胞分析表明Me-cAMP使S期和G2/M期细胞数目比例显著下降。qRT-PCR及Western blot实验表明α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ胶原的表达与模型组比较,均呈现出显著下降。当EPAC被激活之后,EPAC的下游分子Rap1活性形式Rap1-GTP的蛋白表达也同样上升。以上结果提示,在HSC存在EPAC/Rap1信号通路,并且EPAC激活后,乙醛诱导的的HSC-T6的激活和增殖均受到抑制。3、EPAC siRNA在乙醛刺激的HSC—T6中的作用建立上述HSC模型,设计并合成EPAC1和EPAC2小干扰RNA (small interfering RNA,siRNA),通过脂质体Lipofectamine TM 2000瞬时转染至HSC-T6细胞内,荧光倒置显微镜观察细胞的转染效率,同样利用MTT法检测EPAC siRNA对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测其对细胞周期的影响；qRT-PCR及Western blot法分别检测HSC-T6的a-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA及蛋白表达。将EPAC1和EPAC2 siRNA转染至HSC-T6细胞内,与阴性对照组相比EPAC1和2表达水平明显降低。MTT实验结果说明单独应用EPAC1 siRNA和同时应用EPAC1和2 siRNA均使乙醛诱导的HSC-T6细胞增殖活力增强,而单独应用EPAC2 siRNA可使乙醛诱导的HSC-T6细胞增殖活力减弱。细胞周期结果也表明只有单独应用EPAC2 siRNA使S期和G2/M期的细胞数目比例显著下降。当靶向封闭EPAC1和EPAC2基因的表达时,α-SMA、I型和III胶原mRNA及蛋白表达亦明显降低。将EPAC1 siRNA转染至HSC-T6细胞内,α-SMA、型和III胶原mRNA及蛋白表达升高;将EPAC2 siRNA转染至HSC-T6细胞内,α-SMA、I型和III胶原mRNA及蛋白表达降低。上述结果说明,EPAC2沉默可抑制乙醛诱导的HSC-T6活化与增殖,而EPAC1沉默进一步加强了乙醛诱导的HSC-T6活化与增殖。4、EPAC和PKA激活对乙醛刺激的HSC—T6表达I型和III胶原及α-SMA的作用不同实验设正常对照组(常规培养),模型组,Me-cAMP组,PKA激动剂(N6-phenyladenosine-3,5-cyclic monophosphate, Phe-cAMP)组,除正常对照组外其余各组均以200 μM乙醛作用48 h,制备大鼠酒精性肝纤维化HSC模型。Me-cAMP和Phe-cAMP组在乙醛作用24 h后再加入继续共同作用24 h。qRT-PCR及Western blot法分别检测HSC-T6的α-SMA、I型和Ⅲ胶原mRNA和蛋白表达以及Rap1的蛋白表达。与模型组相比,Me-cAMP抑制了细胞中α-SMA,I型和Ⅲ胶原的蛋白的表达；而PKA激动剂Phe-cAMP促进了α-SMA, collagen I和Ⅲ的蛋白的表达,与课题组前期研究结果一致。EPAC激动剂可使小G蛋白Rap1活性形式Rap1-GTP表达增多,而PKA激动剂Phe-cAMP却对Rap1和GTP结合影响不大。这些数据表明,在乙醛诱导的HSC-T6中EPAC和PKA的激活对α-SMA,I型和Ⅲ胶原表达可能起到不同的作用；而EPAC可能通过Rap1发挥作用。综上所述,在大鼠酒精肝纤维化HSC模型中,EPAC2表达较正常组升高,而EPAC1的表达降低。 使用EPAC激动剂Me-cAMP和沉默EPAC2基因的表达均可明显抑制HSC-T6细胞的活化增殖。EPAC激动剂Me-cAMP不仅较大程度的增加了EPAC1的表达,而且增加了EPAC下游Rap1活性形式Rap 1-GDP的表达。运用EPAC激动剂Me-cAMP和PKA激动剂Phe-cAMP发现在乙醛诱导的HSC-T6中EPAC和PKA的激活对α-SMA,Ⅰ型和Ⅲ胶原表达可能起到不同的作用;而EPAC可能通过Rap1发挥作用。以上结果说明EPAC/Rap1信号通路激活可以抑制乙醛诱导的大鼠肝星状细胞激活和增殖。
【关键词】：乙醛 大鼠肝星状细胞 EPAC1 EPAC2 Rap1
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 英文缩略词5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 1 前言15-16
• 2 实验材料16-22
• 3 实验方法22-31
• 4 实验结果31-44
• 5 讨论44-48
• 6 结论48-49
• 参考文献49-54
• 附录54-55
• 致谢55-56
• 综述56-67
• 参考文献63-67

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