原发性胆汁性肝硬化模型鼠调节性T细胞的系统生物学分析及治疗靶点探究

发布时间：2017-09-18 21:50

  本文关键词：原发性胆汁性肝硬化模型鼠调节性T细胞的系统生物学分析及治疗靶点探究

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【摘要】：原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种自身免疫介导的渐进性胆汁淤积性肝脏疾病,涉及诸多的免疫细胞参与疾病发展进程,但是每种细胞所发挥的特定功能却依然不甚明确。CD4+Foxp3+调节性T细胞(Tregs)在维持免疫稳态,阻止过度免疫应答方面具有不可替代的作用,无论在人类PBC还是小鼠模型中均出现了明显的Tregs缺陷。本论文的研究工作基于PBC小鼠疾病模型一一显性失活的转化生长因子βⅡ型受体(dnTGF-βRⅡ转基因小鼠,寻找对三个基本问题的答案：第一、小鼠PBC模型中的Tregs的缺陷出现在什么范畴；第二、小鼠PBC模型中的Tregs在疾病进程中是否依然具有对过度免疫应答的抑制能力,即Tregs究竟扮演积极亦或消极的作用；第三、将小鼠PBC模型中的CD4+T细胞置换为正常的CD4+T细胞是否足以逆转胆管炎症的发生。 首先,使用高分辨率的微阵列技术,配合定量PCR和流式细胞术对结果的严格确认,我们发现dnTGF-βRⅡ来源的Tregs同正常小鼠来源的Tregs之问存在广泛差别。重要的转录因子Eos、Ahr、Klf2、Foxp1在dnTGF-βRⅡTregs中显著下调。而且在Tregs功能方面,模型鼠Tregs表现出高度活化,甚至是促炎性的表型,譬如上调Ccl5、Granzyme B和IFN-γ。基因通路的分析暗示,初始的TGF-p信号的缺失可能是造成免疫调节功能下调的诱因。这些发现细致的描绘了模型鼠Tregs存在的遗传缺陷,并强调出一些需要在人类PBC研究中拓展研究的基因和信号通路。生物信息学层次提供的信息揭示了模型鼠Tregs所存在TGF-β信号依赖和非依赖的异常。 随后,我们构建了CD4+T细胞缺陷,同样包含Tregs缺陷的dnTGFβRⅡ;CD4小鼠。与dnTGF-βRⅡ小鼠相比,dnTGFβRⅡ;CD4-/-小鼠出现了更为严重的胆管炎症。在CD4+T细胞缺陷的情况下,肝内浸润的淋巴细胞总数以及效应性CD8+T细胞的数量显著增加。这暗示dnTGFβRⅡ的Tregs对免疫系统依然具有负调作用。而体外共培养抑制实验的结果也表明dnTGF-βRⅡ的Tregs相对于WT的Tregs依然具有抑制功能,但是能力显著削弱。 进一步,我们发现,如果使用dnTGFβRⅡ;CD4-/-和B6;CD8-/-小鼠的骨髓构建骨髓嵌合模型,在嵌合鼠中野生型CD4+T细胞回补的条件下,嵌合鼠的胆管炎症明显减轻。我们还使用了连体共生的手段,构建了dnTGFβRⅡ;CD4-/-小鼠与野生型小鼠的血液嵌合模型,得到了同骨髓嵌合模型相似的结果。这些结果表明,在致病性的CD8+T细胞依然存在的情况下,纠正CD4+T细胞所出现的缺陷就足以消除疾病的主要特征,因此针对CD4+T细胞的靶向治疗也许能够有效的治疗PBC疾病。
【关键词】：原发性胆汁性肝硬化 调节性T细胞 CD4~+T细胞 转录因子Foxp3 转化生长因子β 小鼠疾病模型 遗传学通路分析 骨髓嵌合 连体共生
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.22;R-332
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 符号说明9-15
• 图序15-17
• 表序17-18
• 第一章 绪论18-58
• 1.1 原发性胆汁性肝硬化(PBC)概述18-24
• 1.2 原发性胆汁性肝硬化(PBC)小鼠模型的构建24-36
• 1.2.1 自发型PBC动物模型25-33
• 1.2.2 实验诱导型PBC动物模型33-36
• 1.3 调节性T细胞(Treg)概述36-55
• 1.3.1 Treg研究简史36-40
• 1.3.2 Treg起源和产生40-46
• 1.3.3 Treg免疫调节功能实现的分子基础46-52
• 1.3.4 Treg的可塑性(Plasticity)和稳定性(Stability)52-55
• 1.4 Treg和自身免疫肝脏疾病PBC的联系55-58
• 第二章 材料与方法58-94
• 2.1 实验材料58-66
• 2.1.1 实验动物58
• 2.1.2 小鼠手术中使用的试剂58
• 2.1.3 小鼠组织DNA的提取和基因型鉴定中使用的试剂58-59
• 2.1.4 小鼠外周血表型检测中使用的试剂材料59
• 2.1.5 小鼠各脏器单个核细胞分离试剂和配置59
• 2.1.6 FACS检测中使用的试剂59-63
• 2.1.7 细胞磁分选和培养试剂材料63
• 2.1.8 真核细胞总RNA提取和实时荧光定量PCR使用的试剂和材料63-64
• 2.1.9 病理样品制作使用的试剂和材料64-65
• 2.1.10 构建小鼠骨髓嵌合模型中使用的试剂65-66
• 2.2 实验仪器和设备66-68
• 2.2.1 小鼠手术器械66
• 2.2.2 小鼠各组织脏器单个核细胞分离仪器66
• 2.2.3 磁性细胞分选使用的器械66
• 2.2.4 细胞培养实验用耗材和仪器66-67
• 2.2.5 病理仪器设备67
• 2.2.6 流式细胞仪67-68
• 2.2.7 小鼠组织DNA提取及基因鉴定的设备68
• 2.2.8 其他仪器68
• 2.3 实验方法68-94
• 2.3.1 转基因小鼠的繁育68
• 2.3.2 分子生物学实验方法68-74
• 2.3.3 小鼠脏器组织中免疫细胞的分离74-75
• 2.3.4 细胞计数75
• 2.3.5 流式细胞分析,flow based analyzing75-77
• 2.3.6 流式细胞分选,flow based sorting77-79
• 2.3.7 调节性T细胞分选和体外共培养抑制实验79-82
• 2.3.8 调节性T细胞表达谱分析82-83
• 2.3.9 生物信息学信号通路分析方法83-85
• 2.3.10 使用DynaBeads富集目的细胞(阴性分选)85
• 2.3.11 骨髓嵌合小鼠的构建85-86
• 2.3.12 构建循环系统嵌合的连体共生小鼠86-87
• 2.3.13 病理HE染色样品制作87-91
• 2.3.14 病理打分标准91-92
• 2.3.15 统计学分析方法92-94
• 第三章 结果与讨论94-135
• 3.1 引言94-95
• 3.2 dnTGF-βRⅡ小鼠Treg呈现质量而非数量的缺陷95-96
• 3.2.1 dnTGF-βRⅡ小鼠各脏器Treg比例和数量均未降低95-96
• 3.3 dnTGF-βRⅡ小鼠Treg转录组学分析和结果验证96-113
• 3.3.1 dnTGF-βRⅡ小鼠Treg与野生型Treg转录组学比对分析96-99
• 3.3.2 dnTGFβRⅡ的Treg组学分析结果的验证99-104
• 3.3.3 PBC模型鼠调节性T细胞转录组通路分析104-113
• 3.4 dnTGF-βRⅡ小鼠Treg抑制功能探究113-119
• 3.4.1 CD4缺陷的dnTGFβRⅡ小鼠出现更严重的胆管炎症113-119
• 3.5 WT CD4~+T细胞对胆管炎治疗潜力的评价119-127
• 3.5.1 dnTGFRⅡ；CD4~(-/-)与WT；CD8~(-/-)骨髓嵌合鼠的胆管炎症减轻119-124
• 3.5.2 dnTGFβRⅡ;CD4~(-/-)与WT血液嵌合鼠显示胆管炎减轻124-127
• 3.6 讨论127-135
• 3.6.1 对dnTGF-βRⅡTreg与WT Treg生物信息学分析的讨论127-129
• 3.6.2 置换CD4~+T细胞对PBC治疗潜力的讨论129-131
• 3.6.3 实验中存在的问题和缺陷131-133
• 3.6.4 基于dnTGFβRⅡ小鼠模型对PBC研究的展望133-135
• 参考文献135-157
• 致谢157-159
• 第四章 攻读博士期间的主要研究成果159-161
• 4.1 发表和拟发表学术论文情况159
• 4.2 攻读博士期间参加的学术会议和培训159-160
• 4.3 攻读博士期间所获得的奖励160-161
• 附录161-164

【共引文献】

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本文编号：877718