体外高表达TL1A的巨噬细胞对肝星状细胞活化、增殖的影响

发布时间：2017-10-01 21:31

  本文关键词：体外高表达TL1A的巨噬细胞对肝星状细胞活化、增殖的影响

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【摘要】：肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的活化和增殖是肝纤维化发生的中心环节,活化的HSCs是合成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的主要细胞,HSCs的活化与增殖可大量合成ECM,在肝组织内异常沉积,从而引起肝纤维化。巨噬细胞作为机体重要的固有免疫细胞,在HSCs活化、增殖中起到调控作用。在肝纤维化进展过程中,寄居在肝脏中的巨噬细胞(macrophages,M?)即枯否细胞(Kuffer cells,KCs)通过分泌肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(interleukin,IL-1β)和血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor,PDGF-BB)等促炎、促纤维化因子造成肝细胞损伤,促进HSCs的活化与增殖;而被激活的HSCs和损伤的肝细胞分泌CC族趋化因子2(CC chemokine ligan 2,CCL2)为主的趋化因子进一步募集血液中的单核巨噬细胞加重肝损伤和促进肝纤维化发生。因此,研究巨噬细胞的功能及其对HSCs的影响对进一步了解肝纤维化发生机制非常重要。肿瘤坏死因子样配体1A(tumor necrosis factor-like ligand 1 aberrance,TL1A)是肿瘤坏死因子超家族成员15(tumor necrosis factor superfamily member 15,TNFSF15)基因的蛋白产物,主要在内皮细胞、淋巴细胞、浆细胞、单个核细胞和树突细胞表达。我们课题组前期研究证明,TL1A可促进慢性实验性结肠炎小鼠肠纤维化的发生以及促进肠组织中巨噬细胞的活化与募集。目前为止对于TL1A在肝脏疾病中的研究比较少见,在原发性胆汁性肝硬化患者血清和肝组织巨噬细胞中TL1A表达升高,且在熊去氧胆酸治疗后血清TL1A水平下降。由此可见TL1A的高表达有可能促进肝纤维化发生。TL1A作为TNF的唯一配体,可通过与其受体死亡受体3(death receptor 3,DR3)结合,诱导巨噬细胞的活化。既往有大量体外研究证实巨噬细胞可促进HSCs的活化、增殖,但尚无研究TL1A高表达的巨噬细胞对HSCs活化增殖的影响。为此,本实验在于探索体外高表达TL1A的巨噬细胞对HSCs活化、增殖的影响,有可能为肝纤维化的治疗提供新靶点。目的:探讨体外高表达TL1A的巨噬细胞对肝星状细胞的活化、增殖的影响。方法:(1)采用real-time Q-PCR方法进行FMS-TL1A-GFP transgenic基因型小鼠的鉴定与筛选;(2)分离、分化并活化C57BL/6野生型(wild type,WT)与转基因(transgenic,Tg)小鼠骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)和腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages,PMs);采用原位循环灌流和密度梯度离心技术分离WT小鼠原代HSCs;(3)实验分组:M?部分:BMMs与PMs分别分为Control/WT组、LPS+IFN-γ/WT组、Control/Tg组、LPS+IFN-γ/Tg组;HSCs部分:收取LPS+IFN-γ/WT组及LPS+IFN-γ/Tg组培养液上清,为条件培养基(conditional medium,CM);将CM分别干预小鼠原代HSCs,实验分组如下:Control组,以含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养小鼠原代HSCs;LPS+IFN-γ+M-CSF组,以含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液培养小鼠原代HSCs,并加入LPS、IFN-γ和M-CSF(PMs来源的CM培养HSCs不加M-CSF);CM WT组,用含10%胎牛血清的LPS+IFN-γ/WT组条件培养基培养小鼠原代HSCs;CM Tg组,用含10%胎牛血清的LPS+IFN-γ/Tg组条件培养基培养小鼠原代HSCs;(4)荧光显微镜观察刚分离的原代HSCs;免疫荧光法检测M?F4/80与TL1A共表达情况以及HSCs标志物结蛋白(desmin)与α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达情况;CCK-8法检测M?CM促HSCs增殖的最适浓度以及CCK-8法及Brd U法检测HSCs增殖情况;real-time Q-PCR方法检测M?TL1A与DR3以及HSCs 2、4、6天的α-SMA m RNA表达情况;Western blot方法检测M?TL1A与DR3蛋白表达情况;酶联吸附反应试验(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)测定各组M?培养上清液中IL-1β和PDGF-BB的含量。结果:(1)根据基因FMS-TL1A-GFP序列测定小鼠DNA,Tg小鼠目的基因测定成像在191 bp位置,而WT小鼠基因测定成像,在191 bp位置未检测到目的基因,据此筛选鉴定Tg小鼠。(2)成功分离出BMMs及PMs,每只小鼠细胞得率分别为90×106~110×106、10×106~12×106,细胞存活率大于95%。(3)免疫荧光细胞化学结果显示M?胞膜有F4/80表达,且Tg组TL1A蛋白表达水平较WT组明显升高(BMMs:0.029±0.002 vs0.011±0.002,P0.01;PMs:0.025±0.002 vs 0.010±0.002,P0.01);对于BMMs,real-time Q-PCR方法检测TL1A m RNA在各组表达结果显示:巨噬细胞加入LPS、IFN-γ刺激后TL1A m RNA表达量较相应对照组明显升高,P0.01,且与LPS+IFN-γ/WT组相比,LPS+IFN-γ/Tg组升高更明显,差异具有统计学意义,P0.01;Western blot方法检测TL1A蛋白在各组表达结果显示:LPS+IFN-γ/WT组较Control/WT组TL1A蛋白表达无明显差异,P0.05,Tg小鼠巨噬细胞TL1A蛋白表达量明显高于WT小鼠巨噬细胞,P0.01,且与Control/Tg组相比,LPS+IFN-γ/Tg组升高更为显著,P0.01;对于PMs的检测结果与上述趋势一致,证明成功提取出TL1A高表达的M?。(4)BMMs和PMs的DR3 m RNA和蛋白表达水平各组之间无明显差异,P0.05。(5)采用肝脏原位灌注法,以Percoll为介质密度梯度离心,分离小鼠原代HSCs。细胞得率为0.8×106~1.0×106/只,存活率和纯度均大于90%。在倒置显微镜下观察刚分离出的HSCs呈圆形,胞浆中含有较多脂滴,在波长328 nm的荧光显微镜下观察,HSCs自发蓝色荧光;24 h HSCs贴壁后进行免疫荧光法可检测到desmin。(6)CCK-8法结果显示应用60%BMMs和PMs来源的CM培养HSCs 24 h对其促进增殖效果最为显著。(7)CCK-8法检测HSCs增殖速率结果显示:应用BMMs来源的CM培养HSCs,LPS+IFN-γ+M-CSF组(100.54%±8.11%)与Control组(100.82%±8.48%)无明显差异(P0.05),而与Control组及LPS+IFN-γ+M-CSF组相比,应用CM培养的HSCs增殖速率显著升高,且CM Tg组(246.21%±8.34%)明显高于CM WT组(203.24%±10.50%),差异具有统计学意义(P0.01);应用PMs来源的CM培养HSCs,检测结果与上述趋势一致。(8)Brd U法检测HSCs DNA合成速率结果显示:应用BMMs来源的CM培养HSCs,LPS+IFN-γ+M-CSF组(102.01%±8.04%)与Control组(100.00%±8.62%)无明显差异(P0.05),而与Control组及LPS+IFN-γ+M-CSF组相比,应用CM培养的HSCs DNA合成速率显著升高,且CM Tg组(182.24%±8.68%)明显高于CM WT组(150.75%±9.12%),差异具有统计学意义(P0.01);应用PMs来源的CM培养HSCs,检测结果与上述趋势一致。(9)应用BMMs来源的CM培养HSCs,免疫荧光法分别检测2、4、6天α-SMA蛋白表达量,结果显示:第2天和第6天时各组间无明显差异,P0.05;第4天时Control组与LPS+IFN-γ+M-CSF组无明显差异(P0.05),与Control组及LPS+IFN-γ+M-CSF组相比,应用CM干预的HSCsα-SMA表达水平显著升高,且CM/Tg组明显高于CM/WT组,差异具有统计学意义(P0.01);PMs来源的CM培养HSCs的检测结果与上述趋势一致。(10)应用BMMs来源的CM培养HSCs,real-time Q-PCR法分别检测2、4、6天α-SMA m RNA表达含量,结果显示:第2天时各组无明显差异,P0.05;第4天时Control组与LPS+IFN-γ+M-CSF组无明显差异(P0.05),与Control组及LPS+IFN-γ+M-CSF组相比,CM组α-SMA表达水平显著升高(P0.01),且CM/Tg组明显高于CM/WT组,差异具有统计学意义(P0.05);第6天时Control组与LPS+IFN-γ+M-CSF组无明显差异(P0.05),与Control组及LPS+IFN-γ+M-CSF组相比,CM组α-SMA表达水平显著升高,且CM/Tg组明显高于CM/WT组,差异具有统计学意义(P0.01);PMs来源的CM培养HSCs的检测结果与上述趋势一致。(11)ELISA检测结果显示:对于BMMs的培养上清液,加入LPS和IFN-γ刺激后的巨噬细胞与相应对照组相比,IL-1β和PDGF-BB表达水平显著升高(P0.01),且LPS+IFN-γ/Tg组比LPS+IFN-γ/WT组升高更明显,差异具有统计学意义(P0.01);而对于PMs的培养上清液,除LPS+IFN-γ/Tg组比LPS+IFN-γ/WT组的PDGF-BB升高明显(P0.05)外,余检测结果与上述趋势一致。结论:高表达TL1A的巨噬细胞可能通过IL-1β和PDGF-BB分泌增加促进HSCs的活化与增殖。
【关键词】：肝纤维化 巨噬细胞 肝星状细胞 肿瘤坏死因子样配体1A 死亡受体3 白介素-1β 血小板衍生生长因子-BB
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-16
• 材料与方法16-30
• 结果30-37
• 附图37-49
• 附表49-51
• 讨论51-54
• 结论54-55
• 参考文献55-58
• 综述 肝星状细胞活化、增殖的免疫机制研究58-68
• 参考文献63-68
• 致谢68-69
• 个人简历69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Zhi-Zhi Xing;Liu-Ye Huang;Cheng-Rong Wu;Hong You;Hong Ma;Ji-Dong Jia;;Activated rat hepatic stellate cells influence Th1/Th2 profile in vitro[J];World Journal of Gastroenterology;2015年23期

2 Dong-Hong Lu;Xiao-Yun Guo;Shan-Yu Qin;Wei Luo;Xiao-Li Huang;Mei Chen;Jia-Xu Wang;Shi-Jia Ma;Xian-Wen Yang;Hai-Xing Jiang;;Interleukin-22 ameliorates liver fibrogenesis by attenuating hepatic stellate cell activation and downregulating the levels of inflammatory cytokines[J];World Journal of Gastroenterology;2015年05期

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本文编号：955802