LDL诱导的炎症反应中的作用研究

发布时间：2016-11-03 15:11

  本文关键词：自噬在ox-LDL诱导的炎症反应中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

《山东大学》 2014年

自噬在ox-LDL诱导的炎症反应中的作用研究

郝凤成  

【摘要】：心脑血管疾病是目前人类死亡的主要原因之一,动脉粥样硬化是心脑血管疾病的病理基础。动脉粥样硬化由许多因素引起,其发病机制到目前仍未完全明确,许多研究表明脂代谢异常和血管的炎症反应均参与了动脉粥样硬化的形成和发展。血液中的低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)在动脉粥样硬化的发生中占有重要位置,LDL可以引起血管内皮细胞功能障碍和内皮细胞损伤,内皮细胞损伤之后可以促进内皮细胞表面的ICAM1和VCAM1的表达,使得血液中的单核细胞和内皮细胞粘附并向内皮下迁移,单核细胞进入动脉内膜后,吞噬LDL,并使其氧化转变为ox-LDL,同时单核细胞转变为巨噬细胞。巨噬细胞能够分泌多种细胞因子,促进血管的局部炎症反应,加重血管内皮损伤并最终导致动脉粥样硬化的发生和进展。 随着人们对自噬在许多疾病发展过程中的研究,动脉粥样硬化斑块中的自噬现象也引起了人们的关注。近年的研究显示,动脉粥样硬化斑块内的细胞具有一定程度的自噬现象,自噬也是决定其进程的重要影响因素。自噬是真核细胞用来降解和再循环其胞浆内容物的一种方式,基础水平的自噬在血管功能及形态的维持中发挥重要作用。在本研究中,我们观察ox-LDL能否诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC和单核细胞THP1产生自噬,并初步探讨了自噬在ox-LDL诱导的血管局部炎症反应中的作用。第一章自噬在ox-LDL诱导的血管内皮细胞炎症反应中的作用研究目的： 观察ox-LDL(?)能否诱导HUVEC细胞产生自噬,同时用3-MA抑制自噬,探讨自噬对ox-LDL诱导的HUVEC细胞中ICAM1、VCAM1和MCP-1表达的影响。 方法： 1. Western-Blot检测20、40、80μg/ml的ox-LDL作用于HUVEC细胞后LC3的表达变化,免疫荧光检测LC3蛋白在细胞内的分布,从而确定ox-LDL能否诱导HUVEC细胞产生自噬。 2.MDC染色检测20、40、80μg/ml的0x-LDL作用于HUVEC细胞后细胞内的酸性囊泡,通过流式细胞仪检测细胞内MDC的荧光强度,荧光显微镜观察细胞内的酸性囊泡,进一步明确ox-LDL能否诱导HUVEC细胞产生自噬。 3.为了确定自噬对ox-LDL诱导的炎症反应的影响,将实验分为4组：(1)对照组,培养液培养,作为对照；(2)ox-LDL刺激组(80μg/ml);(3)3-MA组(5mmol/L),(4)3-MA(5mmol/L)+ox-LDL (80μg/ml)。Western-Blot检测ox-LDL和3-MA作用后的LC3、ICAM1和VCAM1的表达变化,ELISA检测MCP-1的表达变化。 结果： 1. ox-LDL作用于HUVEC细胞后,可以使LC3的表达明显增高,并且LCI被剪切成LC3Ⅱ的数量明显增多,免疫荧光显示LC3在细胞内的聚集明显增多,细胞内出现典型的点状荧光,这说明ox-LDL引起了细胞内自噬泡的形成。 2.流式结果显示,ox-LDL作用于HUVEC细胞后,细胞内MDC的荧光明显增强。同时在荧光显微镜下观察显示,ox-LDL作用于HUVEC细胞后,细胞中被MDC染色的酸性囊泡明显增多,这些结果进一步表明ox-LDL可以诱导HUVEC细胞产生自噬。 3. Western-blot结果显示,ox-LDL可以使HUVEC细胞中的ICAM1和VCAM1的表达增高,当3-MA抑制自噬后,ox-LDL诱导的ICAM1和VCAM1的表达会进一步升高；ELISA结果显示ox-LDL可以使HUVEC细胞中的MCP-1的表达增高,抑制自噬后,ox-LDL诱导的MCP-1的表达会进一步升高。 结论： ox-LDL可以诱导脐静脉内皮细胞HUVEC产生自噬,抑制自噬后,可以使ox-LDL诱导的炎症反应进一步增强,说明自噬对ox-LDL诱导的炎症反应起到一定的保护作用。 第二章自噬在ox-LDL诱导的单核细胞炎症反应中的作用研究 目的：观察ox-LDL能否诱导单核细胞THP1细胞产生自噬,同时用3-MA抑制自噬,探讨自噬对ox-LDL诱导的THP1细胞中TNF-α、IL-1和IL-6表达的影响。 方法： 1.Westem-Blot检测20、40、80μg/ml的ox-LDL作用于THP1细胞后LC3的表达变化,免疫荧光检测LC3蛋白在细胞内的分布,确定ox-LDL能否诱导THP1细胞产生自噬。 2.MDC染色检测20、40、80μg/ml的ox-LDL作用于THP1细胞后细胞内的酸性囊泡,通过流式细胞仪检测细胞内MDC的荧光强度,荧光显微镜观察细胞内的酸性囊泡,进一步明确ox-LDL能否诱导THP1细胞产生自噬。 3.为了确定自噬对ox-LDL诱导的炎症反应的影响,将实验分为4组：(1)对照组,培养液培养,作为对照；(2)ox-LDL刺激组(80μg/ml)；(3)3-MA组(5mmol/L), (4)3-MA(5mmol/L)+ox-LDL(80μg/ml)。Western-Blot检测ox-LDL和3-MA作用后的LC3的表达变化,ELISA检测]TNF-α、IL-1和IL-6表达的变化。 结果： 1.ox-LDL作用于THP1细胞后,可以使LC3的表达明显增高,并且LCI被剪切成LC3Ⅱ的数量明显增多,免疫荧光显示LC3在细胞内的聚集明显增多,细胞内出现典型的点状荧光,这就说明ox-LDL引起了细胞内自噬泡的形成。 2.流式结果显示,ox-LDL作用于THP1细胞后,细胞内MDC的荧光明显增强。同时在荧光显微镜下观察显示,ox-LDL作用于THP1细胞后,细胞中被MDC染色的酸性囊泡明显增多,这些结果进一步表明ox-LDL可以诱导THP1细胞产生自噬。 3.Western结果显示,加入3-MA后,可以使ox-LDL诱导的LCⅡ的表达下降,说明3-MA可以抑制ox-LDL诱导的自噬；ELISA结果显示ox-LDL可以使THP1细胞中的TNF-α、IL-1和IL-6的表达增高,抑制自噬后,ox-LDL诱导的TNF-α、IL-1和IL-6的表达会进一步升高。 结论： ox-LDL可以诱导单核细胞THP1产生自噬,抑制自噬后,可以使ox-LDL诱导的炎症反应进一步增强,说明自噬对ox-LDL诱导的炎症反应起到一定的保护作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R543.5
【目录】：

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