PKD2在Ox-LDL抑制血管内皮细胞eNOS活性中的作用

发布时间：2017-04-05 19:17

  本文关键词：PKD2在Ox-LDL抑制血管内皮细胞eNOS活性中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是发生于全身大中型动脉血管的致命性病变,是导致心肌梗塞和脑梗塞等疾病发生的主要因素。研究表明,AS主要发生于动脉血管的局部性区域,即动脉血管的弯曲处和分叉处。学界认为局部性血流动力学因素所导致的动脉血管内皮损伤是AS形成的一个重要原因。研究发现,在血流动力学信号传导的过程中,内皮细胞纤毛(Cilia)起着关键性作用。其中,主要位于纤毛上的离子通道调控蛋白PKD2[polycystic kidney disease 2(autosomal dominant)]在血管内皮细胞生物学行为和管腔功能稳态维持中起着重要的作用。前期研究结果显示:低振荡剪切应力(OS)可显著地抑制内皮细胞PKD2蛋白的表达,进而导致血管功能障碍乃至AS的形成。同时,已有的研究表明氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)是导致的动脉血管内皮损伤以及AS形成的一个重要原因。那么,Ox-LDL促血管内皮损伤及AS形成是否是通过抑制PKD2蛋白的表达及其功能途径?为此,本文开展了Ox-LDL对血管内皮细胞PKD2蛋白表达及其功能影响的研究。目的:以血管内皮细胞PKD2蛋白功能为研究对象,确定Ox-LDL对PKD2蛋白表达及其功能的影响,以及PKD2调控e NOS的活性的分子信号机制。研究方法:采用实时定量PCR(RT-PCR)检测PKD2和Ca MKKβ等基因的表达水平;免疫荧光染色法(ICC)、Western blotting等方法检测PKD2、Ca MKKβ、p-AMPK、AMPK、p-e NOS蛋白的表达和活性。结果:(1)Ox-LDL可显著抑制内皮细胞PKD2的基因和蛋白表达水平,以及e NOS活性。(2)内皮细胞PKD2基因沉默(si RNA)可显著抑制PKD2的基因和蛋白表达水平,以及PKD2下游靶基因Ca MKKβ、p-AMPK等蛋白的表达和e NOS活性。(3)体外实验初步显示:Ox-LDL可显著抑制PKD2下游靶基因Ca MKKβ的基因表达水平以及AMPK的磷酸化;AMPK的激活剂AICAR可部分补救Ox-LDL下调的PKD2下游靶基因AMPK和e NOS的活性。体内实验证明:长期高脂喂食可显著增加Apo E-/-小鼠的体重和血脂水平,抑制PKD2基因的表达水平。结论:(1)Ox-LDL可抑制内皮细胞PKD2的基因和蛋白表达水平,以及e NOS的活性。(2)Ox-LDL可能通过PKD2信号途径下调内皮细胞e NOS的活性,进而参与血管内皮损伤及动脉粥样硬化的形成。
【关键词】：Ox-LDL PKD2 内皮细胞 eNOS
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 1 绪论9-17
• 1.1 问题的提出与研究意义9
• 1.2 国内外研究现状9-15
• 1.2.1 动脉粥样硬化的研究进展9-10
• 1.2.2 血管内皮细胞在动脉粥样硬化发生、发展中的作用10-11
• 1.2.3 Ox-LDL致动脉粥样硬化的研究进展11-13
• 1.2.4 PKD2在维持血管结构完整和功能性调控中的作用13-15
• 1.3 本文研究目的和研究内容15
• 1.3.1 研究目的15
• 1.3.2 主要研究内容15
• 1.4 本文创新点15-16
• 1.5 技术路线16-17
• 2 Ox-LDL下调内皮细胞PKD2的表达和e NOS活性17-36
• 2.1 引言17-18
• 2.2 实验材料18-21
• 2.2.1 主要仪器设备18
• 2.2.2 实验试剂及药品18-20
• 2.2.3 相关试剂的配制20-21
• 2.3 相关实验方法21-30
• 2.3.1 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养21-23
• 2.3.2 实时定量PCR(RT-PCR)检测mRNA的表达水平23-26
• 2.3.3 免疫荧光染色法检测蛋白表达水平26-27
• 2.3.4 Western blot检测蛋白表达水平27-30
• 2.4 实验结果30-34
• 2.4.1 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养30-32
• 2.4.2 Ox-LDL下调PKD2的表达32-33
• 2.4.3 Ox-LDL下调eNOS的活性33-34
• 2.5 讨论34-36
• 3 PKD2调节AMPK-eNOS信号通路36-44
• 3.1 引言36
• 3.2 实验材料36-38
• 3.2.1 主要仪器设备36-37
• 3.2.2 实验试剂及药品37-38
• 3.2.3 相关试剂的配制38
• 3.3 相关实验方法38-39
• 3.3.1 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养38-39
• 3.3.2 实时定量PCR(RT-PCR)检测mRNA的表达水平39
• 3.3.3 Western blot检测蛋白表达水平39
• 3.4 实验结果39-42
• 3.4.1 PKD2 siRNA下调PKD2的表达39-40
• 3.4.2 PKD2下调eNOS的活性40
• 3.4.3 PKD2介导AMPK途径下调eNOS的活性40-42
• 3.5 讨论42-44
• 4 体内外PKD2介导Ox-LDL抑制的内皮细胞eNOS活性44-54
• 4.1 引言44-45
• 4.2 实验材料45-47
• 4.2.1 主要仪器设备45-46
• 4.2.2 实验试剂及药品46-47
• 4.2.3 相关试剂的配制47
• 4.3 相关实验方法47-48
• 4.3.1 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养47
• 4.3.2 实时定量PCR(RT-PCR)检测mRNA的表达水平47-48
• 4.3.3 Western blot检测蛋白表达水平48
• 4.4 实验结果48-52
• 4.4.1 在体外，Ox-LDL通过AMPK途径下调eNOS的活性48-50
• 4.4.2 在体内，Ox-LDL下调PKD2的表达50-52
• 4.5 讨论52-54
• 5 结论与展望54-55
• 5.1 本研究的主要结论54
• 5.2 后期研究的展望54-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-64
• 附录 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目情况64

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