白藜芦醇通过mTOR信号通路抑制脂多糖诱导的心肌细胞炎症反应的实验研究

发布时间：2017-04-20 05:16

  本文关键词：白藜芦醇通过mTOR信号通路抑制脂多糖诱导的心肌细胞炎症反应的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的大鼠心肌细胞株H9C2心肌细胞产生炎症反应为模型,模拟心肌缺血再灌注后的炎症反应,从细胞、分子和蛋白层面探讨白藜芦醇对心肌缺血再灌注损伤中炎症反应的抑制作用及其信号机制。 [方法]体外培养的大鼠心肌细胞株H9C2心肌细胞随机分成空白对照组、LPS(1μg/ml,20min-24h)处理组、不同浓度的白藜芦醇(0.05、1和10μM,1h)+LPS处理组、不同浓度的白藜芦醇+LPS+Rapamycin (1μM)共同处理组。采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测白藜芦醇、LPS以及Rapamycin对H9C2心肌细胞的活力影响；采用免疫荧光双标记检测方法(double-immunofluorescence labeling assay)在荧光显微镜下观察细胞内诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor, TNF-α)和白介素-6(interleukin-1β, IL-6)蛋白水平的变化；应用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的mRNA水平的变化；采用免疫组化及凝胶迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)方法分别观察NF-κB的核转位情况；采用蛋白质印迹分析方法(western blotting)检测促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)家族的细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2)、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinases, JNK)和p38促分裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinases, p38MAPK)以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)等细胞信号通路蛋白和核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB, IκB)的表达及其变化规律。 [结果]H9C2心肌细胞以1×104cells/ml浓度接种于6孔板中,当密度均匀生长至80%时,使用MTT检测H9C2心肌细胞活力影响,结果显示：经白藜芦醇(0.05、1和10μM)、LPS (1μg/ml)和Rapamycin (1μM)分别处理或共同处理24h后该细胞活性均无明显影响；加入mTOR抑制剂Rapamycin(1μM)1h后,再加入白藜芦醇和LPS处理细胞20min-3h,免疫荧光双标记检测方法、RT-PCR、EMSA、免疫组化以及western blotting分析,得到结果：1)不同浓度的白藜芦醇在转录水平和翻译水平通过mTOR信号通路明显抑制LPS诱导的H9C2心肌细胞促炎性蛋白酶iNOS和COX-2的表达；2)不同浓度的白藜芦醇在mRNA水平和蛋白水平通过mTOR信号通路抑制LPS诱导的H9C2心肌细胞促炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达：3)白藜芦醇可以抑制LPS诱导的IκB磷酸化及NF-κB核转位：4)白藜芦醇能显著增强mTOR信号通路的激活,并能拮抗LPS诱导引起的mTOR信号通路的失活；5)白藜芦醇通过mTOR信号通路抑制LPS诱导的H9C2心肌细胞ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化。 [结论]1)0.05-10μM的白藜芦醇、1μg/ml的LPS和1μM的Rapamycin对细胞活性没有影响；2)白藜芦醇通过mTOR信号通路抑制MAPKs的磷酸化及NF-κB核转位来调控LPS诱导的H9C2心肌细胞内促炎性蛋白酶以及促炎性细胞因子的释放：3)白藜芦醇能激活mTOR信号通路发挥其抗炎作用。
【关键词】：白藜芦醇 脂多糖 炎性因子 mTOR信号通路 MAPKs信号通路 NF-κB信号通路
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R541.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 英文缩略词表9-10
• 前言10-12
• 材料与方法12-32
• 1. 实验仪器、试剂及其配制12-18
• 2. 细胞培养18-19
• 3. 实验细胞分组19-20
• 4. 细胞活性测定20
• 5. 逆转录聚合酶链式反应mRNA水平的检测20-23
• 6. 免疫荧光双标记检测23-24
• 7. 凝胶迁移率实验24-27
• 8. 免疫细胞化学27
• 9. 蛋白质免疫印迹检测27-31
• 10. 统计分析31-32
• 结果32-46
• 讨论46-51
• 结论51-52
• 参考文献52-58
• 文献综述158-64
• 参考文献61-64
• 文献综述264-72
• 参考文献69-72
• 在读期间发表的文章72-73
• 致谢73-74

【共引文献】

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本文编号：317988