冠心病新危险标志物ADMA与促炎因子MIF和AGEs的相关性研究

发布时间：2017-05-04 17:16

  本文关键词：冠心病新危险标志物ADMA与促炎因子MIF和AGEs的相关性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 心血管疾病在发达国家已成为致死率最高的疾病,在发展中国家也日趋严重,每年导致约1670万人死亡。这其中,尤其是冠状动脉粥样硬化性心脏病(又称冠心病,coronary heart disease, CHD)严重威胁现代人类生命健康。CHD根本的病理学特征就是冠状动脉粥样硬化(AS)。近年来随着对疾病的研究深入,证明炎症反应在AS的发生与发展过程中起着重要作用。 目前临床实践中,血清C反应蛋白(CRP)的检测可作为反映机体动脉粥样硬化发生发展过程的一项最敏感的炎性指标。但研究发现,CRP在所有的炎性症状下都会升高,因而对于CHD的诊断缺乏特异性。流行病学研究证明高血脂、高血压、糖尿病以及吸烟等危险因素与冠心病的发生、发展有密切关系。但是大约50%的心血管疾病患者并不能用传统意义上的危险因素来解释。提前诊断对于心血管疾病这类慢性、长期而严重的疾病来说是重要的,因此迫切需要更好的生物标志物来预测未来发生冠心病的风险,这样将在疾病早期就可以进行干预,改善甚至逆转疾病进程。 非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)是蛋白质上的精氨酸残基在蛋白精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferase,PRMT-1)的催化作用下产生;大部分ADMA由二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(Dimethyl arginine dimethylaminohydrolase-2, DDAH-2)水解代谢。ADMA的升高与PRMT-1与DDAH-2这两个酶的活性或含量改变有关。ADMA能与L-精氨酸竞争,是一种内源性的一氧化氮合酶(NOS)竞争性抑制剂,能使具血管保护作用性物质一氧化氮(NO)的生成减少,而导致内皮功能的紊乱。研究表明,高ADMA血症与心脑血管疾病密切相关,ADMA可能是动脉粥样硬化一个新的危险因素。 巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor, MIF)是在结构上高度保守的、独特的免疫调节因子；也是一种强有力的炎症前细胞因子,主要来源于T细胞和单核巨噬细胞。近十年来我们课题组对其做了大量研究,MIF与心血管疾病相关如动脉硬化、心衰等疾病呈正相关性。 晚期糖基化终末产物(advanced glycated end-products, AGEs)是蛋白被糖化修饰后的产物,在正常老化过程中,AGEs逐步形成和积累,但在高血糖或氧化应激条件下AGEs则会加速积累。临床研究证明,AGEs能促进动脉粥样硬化的发生、发展。 为探寻冠心病新的生物标志物,本课题将围绕ADMA与促炎因子MIF、AGEs的关系展开研究。 第一章冠心病患者外周血浆中ADMA、MIF的含量测定 1.1研究目的 检测冠心病患者血浆中ADMA、MIF的含量,并与健康人比较,分析ADMA、MIF与疾病的关系,并进一步分析ADMA与MIF的关系。探讨ADMA是否可作为冠心病潜在的预测、预后指标乃至潜在的治疗耙点。 1.2研究方法 1.2.1标本的采集与处理 1.于2011年7月至2011年12在广东省人民医院心血管病研究所收集经冠状动脉造影确诊为冠心病患者肘静脉血2ml于EDTA抗凝管中(早晨,在患者空腹时),(4℃,1500rpm/min)离心20分钟,收集上层血浆于无菌1.5ml EP管中,-70℃保存,待用；在体检中心收集健康对照人群样本,血液处理方法同上。 2.查询所患者病历,排除标准为长期服用免疫抑制剂史；再发性心肌梗死；恶性肿瘤；肾功能不全；近半年内接受过重大手术；有急性或慢性感染性疾病；严重电解质紊乱的患者。 3.病例组根据有没有接受PCI以及PCI术后的时间长短分为三个亚组：分别指确诊为冠心病但没有接受PCI的病例、刚接受PCI术的病例(七天内)、及人大于6个月的病例。1.2.2人血浆中MIF及ADMA含量的检测 (1) Elisa检测人血浆中MIF的含量 MIF的测定采用定量的酶联免疫测定法(ELISA法)。 (2) Elisa检测人血浆中ADMA的含量 ADMA的测定采用定量的酶联免疫测定法(ELISA法)。1.2.3实时荧光定量PCR检测MIF、CD74mRNA表达水平 提取全血中白细胞总RNA,逆转录成cDNA后,分别使用MIF、CD74的特异引物,内参为β-actin,从基因水平检测mRNA的相对表达。 1.2.4ADMA与MIF的相关性研究 采用Pearson相关分析,分析ADMA与MIF的相关性。 1.3研究结果 1.3.1人血浆中ADMA、MIF及含量的检测 (1)对照组与冠心病组外周血浆中MIF的含量分别为：1103±508.0pg/ml(对照组,n=62)；1422±697.2pg/ml(冠心病组,n=173)(p0.01),差异有统计学意义。接受PCI术后的时间长短与MIF含量无显著关系(p0.05),但可以看到在接受PCI后,随着时间的延长其MIF的含量有降低趋势。 (2)检测ADMA结果为：对照组,170.7±19.93ng/ml,n=24；冠心病组,253.8±12.88ng/ml,n=80p0.01),差异有统计学意义。 1.3.2MIF mRNA与CD74mRNA相对表达水平 冠心病人群中MIF与CD74mRNA的相对表达水平与健康组相比有上升的趋势,但没有统计学差异(见图1-4C)。 1.3.3ADMA与MIF的相关性研究Pearson分析结果为,r=0.238,p=0.035,ADMA与MIF显示出相关性。 1.4结论 本研究结果显示,冠心病患者血浆ADMA与对照组相比明显增高,并伴随着促炎因子MIF的增高,ADMA与MIF显示出相关性。提示ADMA可能参与了慢性炎症过程,并可作为判断冠心病病情活动的有效指标。 第二章ADMA与MIF相互作用的研究 2.1研究目的 以人内皮细胞为研究对象,通过探讨ADMA与MIF相互作用,研究ADMA是否参与了炎症所致的内皮损伤过程及其在动脉粥样硬化中的可能病理生理机制。 2.2实验方法 2.2.1Eahy926细胞的培养 于6孔板中培养,使用DMEM F12培养基,10%FBS,当细胞融合70%时,先用PBS洗两遍,然后加入含1%FBS的培养基过夜后,加入含不同浓度MIF(0,2,5,20ng/ml),共培养24小时。 2.2.2细胞总RNA的提取 按2.2.1方法处理细胞结束后,采用Trizol法提取细胞中的RNA。 2.2.3RT-qPCR检测细胞总RNA中相关蛋白mRNA相对表达水平 首先逆转录为cDNA,然后Q-RCR检测测组织因子(TF)、基质蛋白酶(MMP-1)、内皮素(ET-1)、PRMT-1、DDAH-2、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS) mRNA相对表达水平。 2.2.4硝酸根亚硝酸酶法检测细胞上清中NO水平按2.2.1方法细胞处理结束后,收集细胞培养基上清液测NO。 2.2.5荧光显微镜检测Eahy926中ROS水平 按2.2.1方法处理细胞结束后,加入适量DCFH-DA溶液,使培养液中DCFH-DA终浓度为10μM,将培养板放进37℃培养箱孵育15min。15min后按比例(1：1000)再加入Hoechst33342,37℃培养箱继续孵育15min。去除细胞上清,用PBS轻轻洗2-3次后,每孔加入1mL培养基,荧光显微镜观察各组细胞荧光信号的变化并拍摄荧光照片。 2.2.6ADMA处理内皮细胞后检测MIF的表达 按2.2.1方法处理细胞,采用ADMA处理,分别为0、5、20、ADMA分别采用免疫荧光与Western blot检测MIF的表达水平。 2.3结果 2.3.1细胞总RNA中相关蛋白mRNA相对表达情况 在使用20ng/ml MIF刺激时,ET-1、TF及MMP-1的mRNA的相对表达水平都明显升高(p0.05)；与此同时,与NO生成相关的eNOS、DDAH-2mRNA水平则降低(p0.05),RPMT-1的变化不显著(详细结果见图2-1)。 2.3.2细胞上清中NO水平 加入20ng/ml组NO均值为14.4μM,Control组均值为27.5μMp0.05),差异有统计学意义,其他组变化不显著。 2.3.3内皮细胞中ROS水平 荧光显微镜下,20ng/ml MIF组中,代表ROS水平的绿色荧光比Control增加明显,其他浓度组则增多不明显(详细结果见图2-2)。 2.3.4ADMA处理内皮细胞检测MIF的表达情况 在20、50μMADMA组,MIF的表达明显增多(详细结果见图2-3与2-4)。 2.4结论 MIF能通过影响炎性因子的表达以及ROS的生成,从而影响ADMA相关代谢酶的变化。同时,ADMA亦能上调MIF在内皮细胞中的表达,验证了ADMA的促炎作用。 第三章ADMA与AGEs相互作用的研究 3.1研究目的 探讨AGEs是否影响PRMT-1/ADMA/DDAH-2通路而影响NO的生成,而导致内皮功能紊乱,促进动脉粥样硬化的发生与发展,从而进一步验证ADMA的促炎作用。 3.2研究方法 3.2.1AGEs对ADMA相关代谢酶PRMT-1与DDAH-2的基因表达水平的影响 使用不同浓度的AGEs(0,20,50,100μg/ml)处理Eahy926细胞,并加入没有糖基化的球蛋白做阴性对照,共培养24、48小时。细胞处理结束后,采用Trizol法提取总RNA,实时荧光定量PCR检测PRMT-1与DDAH-2mRNA的相对表达水平。 3.2.2AGEs对ADMA相关代谢酶PRMT-1与DDAH-2的蛋白表达水平的影响 按3.2.1方法细胞处理结束后,提取总蛋白,采用western blot检测PRMT-1与DDAH-2的蛋白表达水平。 3.2.3荧光显微镜检测AGEs处理内皮细胞后ROS的变化 按3.2.1方法细胞处理结束后,按2.2.5法检测ROS。 3.3结果 1. AGEs对ADMA相关代谢酶PRMT-1与DDAH-2的基因表达水平的影响 50μg/ml和100μg/mlAGEs组中,PRMT-1mRNA相对表达水平(folds)与Control组和阴性对照组相比上升明显；而DDAH-2mRNA (folds)与Control组和阴性对照组相比显著下降(p0.01),同时Control组和阴性对照组之间无统计学意义,而25μg/ml组(folds)则与对照组和阴性对照组相比差异不明显。(详细结果见图3-1) 2. AGEs对ADMA相关代谢酶PRMT-1、DDAH-2表达水平的影响 当使用20μg/ml、50μg/ml、100μg/mlAGEs刺激24h时,与Control组相比,PRMT-1蛋白表达上升明显；DDAH-2则在50μg/ml、100μg/mlAGEs刺激24h时下降；同时在培养48小时时,看到了相同的趋势。(详细结果见图3-2与3-3) 3.荧光显微镜检测AGEs处理内皮细胞后ROS的变化 荧光显微镜下观察,与对照组和阴性对照组相比,加入20gg/ml、50μg/ml、100μg/mlAGEs各组中,代表ROS绿色荧光相对生成较多,其中100μg/mlAGEs组ROS含量最多。(详细结果见图3-4) 3.4结论 AGEs可以通过诱导ROS的生成,影响PRMT-1/ADMA/DDAH-2通路。 全文小结： 1.本研究结果显示,冠心病患者血浆ADMA与对照组相比明显增高,并伴随促炎因子MIF的增高,ADMA与MIF显示出相关性。揭示了炎性反应、内皮功能与心血管疾病之间的关系,提示ADMA可能参与了慢性炎症过程,并可作为判断冠心病病情活动的有效指标。 2.发现了MIF能够影响ADMA-NO通路,而ADMA也能增加MIF的表达,验证了ADMA的促炎作用。 3. AGEs通过诱导ROS生成,影响PRMT-1/ADMA/DDAH-2通路。
【关键词】：非对称性二甲基精氨酸 巨噬细胞动抑制因子 晚期糖基化终末产物 冠心病
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R541.4;R96
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 第一章 冠心病患者外周血浆中MIF、ADMA的含量测定22-44
• 前言22-28
• 1.1 主要试剂与仪器28-29
• 1.2 主要试剂配置29-30
• 1.3 实验方法30-36
• 1.4 统计方法36
• 1.5 结果36-40
• 1.6 讨论40-44
• 第二章 ADMA与MIF相互作用的研究44-61
• 前言44
• 2.1 主要试剂和仪器44-46
• 2.2 主要配置的试剂46-47
• 2.3 方法47-53
• 2.4 统计学方法53-54
• 2.5 结果54-58
• 2.6 讨论58-61
• 第三章 ADMA与AGEs相互关系的研究61-71
• 前言61-62
• 3.1 主要试剂与仪器62
• 3.2 主要试剂与配置62-63
• 3.3 实验方法63-65
• 3.4 结果65-69
• 3.5 讨论69-71
• 展望71-72
• 全文总结72-73
• 参考文献73-80
• 缩写词简表80-82
• 硕士研究生期间发表论文情况82-83
• 参加国内国际会议83-84
• 致谢84-86
• 统计学审稿证明86

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