rAAV8-hFⅧ治疗血友病A的临床前研究

发布时间：2022-02-22 15:18

　　目的：研究一种新型的AAV重组病毒（rAAV8-hFVIII）治疗血友病A的治疗效果,并在病毒设计构建中引入定点整合概念,为血友病A的基因治疗提供方向。方法：动物实验方面,我们在本实验中引入两个种群的老鼠：携带人体AAVS1位点的转基因小鼠（AAV小鼠）和敲除FⅧ的基因小鼠（FVIII KO小鼠）,将其分为高压注射组,正常注射组和溶剂空白对照组。目的基因表达方面,我们使用ELISA检测hFVIII蛋白1、7、14、21、35、60、90天抗原抗体表达情况；在100天时,杀死小鼠取其心、肝、脾、肺、肾,使用RT-PCR检测病毒转录情况。生理出凝血指标方面,我们采用活化部分凝血活酶时间检测法来观察30天时FVIII KO小鼠内源性凝血指标的变化,同时用小鼠断尾法检测小鼠生理出血时间的变化。AAVS1特异位点整合方面,我们在部分AAV小鼠上加入Rep共同高压注射,使用nested PCR检测接头序列,并在100天时对小鼠进行肝脏部分切除手术,使用Real-time PCR观察其表达变化。结果：FⅧ抗原检测结果显示,在使用相同给药方式的条件下,两种不同模型动物的蛋白表达相似,一般在病毒注射60... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：64 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
目录
英文縮略词
第一章 前言
第二章 材料与方法
    一、实验材料
        1、动物实验材料
        2、其它制剂、溶液
        3、常用试剂配制
        4、主要仪器设施
        5、计算机软件及数据库
    二、实验方法
        1、琼脂糖凝胶电泳方法
        2、pMD18-T载体和目的基因的连接
        3、质粒的转化
        4、质粒的小量制备
        5、组织DNA抽提
        6、组织mRNA抽提
        7、高压尾静脉快冲注射
        8、动物实验与血浆、血清采集
        9、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血浆中hFⅧ抗原
        10、FⅧKO小鼠出血时间测定与APTT部分凝血酶激活时间检测
        11、RT-PCR检测hFⅧ mRNA
        12、肝脏部分切除
        13、Real-time PCR检测病毒在体内的表达
        14、鼠肝PCR扩增检测病毒-AAVS1整合位点接头序列
        15、ELISA检测小鼠血清中hFⅧ抗体的相对水平
        16、统计学分析
第三章 实验结果
    一、hFⅧ表达及其抗体形成
        1、hFⅧ在实验小鼠体内的表达情况
        2、抗hFⅧ抗体水平
    二、模型动物的出、凝血指标
        1、小鼠出血时间
        2、APTT部分活化的凝血活酶时间
    三、病毒的体内分布、表达及特异性位点整合情况
        1、RT-PCR检测病毒进入肝脏后在器官内分布情况
        2、nested PCR检测AAVS1接头位点序列
        3、Real-time PCR检测肝切前后肝脏rAAV8-hFⅧ表达
第四章 讨论与结论
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间发表的学术论文目录
致谢



本文编号：3639712