NT-proBNP单克隆抗体的研制及ELISA定量检测方法的建立

发布时间：2017-05-16 07:39

  本文关键词：NT-proBNP单克隆抗体的研制及ELISA定量检测方法的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:心衰是导致多数心脏病人死亡的最终发展阶段,严重影响了患者的生命健康。因此,如何在心衰发病的早期及时诊断、指导临床医生尽早开展抗心衰的治疗一直是人们研究的热点。研究发现:N端前脑钠肽(NT-pro BNP)是判定心衰进程、发展的主要标志物,其含量变化可敏感及特异地反应心室功能的变化和心脏功能的损伤及损伤程度。目前国内关于NT-pro BNP检测产品技术的研究处于起步阶段,所需抗体等主要材料大多依赖进口。因此,本研究拟通过制备抗NT-pro BNP单克隆抗体、并以此为基础建立一种检测人血清中N端前脑钠肽含量的双抗体夹心ELISA检测方法来推动国内该疾病检测方法的进步。方法:1.将NT-pro BNP抗原免疫BABL/c小鼠,经细胞融合、阳性细胞株筛选制备NT-pro BNP单克隆抗体。用分别与OVA耦联的线性表位片段18~38、35~50、55~72筛选确定所得单抗针对的线性表位,并通过间接ELISA特异性分析及亚型分析方法对所得单抗进行特异性及亚型鉴定。2.通过双抗体夹心ELISA法对所得单抗筛选获取配对单抗,并以此为基础通过包被与封闭条件、包被与酶标抗体工作浓度、反应模式、室内质控品及标准品的建立、线性范围、批内、批间精密性、回收率、干扰因素等方面的研究,建立人N端前脑钠肽ELISA定量检测方法。结果:1.共获得15株单克隆抗体。单抗亚型及表位鉴定显示:10株为Ig G1亚型,这10株中有5株针对18~38线性表位,2株抗体针对35~50线性表位,3株抗体针对55~72线性表位,且与心衰相关标志物均无交叉反应。其中,5E10和5G5抗体配对。另外5株不是针对特异性表位抗原的单克隆抗体,舍弃。2.本实验建立的双抗体夹心ELISA检测方法的条件为:包被抗体浓度为4μg/m L,酶标稀释倍数为1:3 000;反应模式为两步法反应模式:37℃样本孵育30 min,酶标孵育30 min,显色20 min。3.建立的NT-pro BNP检测方法:线性范围为50~500 pg/m L,批内及批间精密性分别为2.3%和3.4%。低值、中值及高值的回收率分别为93.7%、97.2%、101.2%。干扰因子脂血、黄疸及低浓度溶血等对试验结果无影响。用200份临床血清测试,该试剂临床总符合率为96.9%,用48份与国外试剂盒平行测试,结果表明两者具有相关性,回归方程:Y=0.8017X+188.3,R2=0.9027。结论:1.利用单抗制备技术成功制备出10株NT-pro BNP单抗,并筛选出1对最优的NT-pro BNP检测用配对单抗。2.初步建立了一种用于人血清中N端前脑钠肽含量检测的ELISA方法,该方法具有较高的特异性和精密性。可初步应用于临床对NT-pro BNP的检测,为心衰的早期诊断提供了帮助。
【关键词】：N 端前脑钠肽 单克隆抗体 酶联免疫反应
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.6
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 符号与缩略语11-12
• 常用单位12-13
• 1 引言13-20
• 1.1 项目背景13-14
• 1.2 NT-proBNP的生物学特征14
• 1.3 NT-proBNP与相关疾病的关系14-17
• 1.3.1 NT-proBNP与心衰严重程度14-15
• 1.3.2 NT-proBNP、BNP与高血压并发症15
• 1.3.3 NT-proBNP与冠状动脉粥样硬化性疾病15-16
• 1.3.4 NT-proBNP与急性冠脉综合征16
• 1.3.5 NT-proBNP与心房纤颤16
• 1.3.6 NT-proBNP与稳定型冠心病16-17
• 1.4 检测方法的发展历程17-19
• 1.4.1 BNP的放射免疫检测技术17
• 1.4.2 竞争性血浆BNP检测方法17-18
• 1.4.3 BNP非竞争性免疫检测技术18
• 1.4.4 BNP及NT-proBNP的自动化及快速检测技术18-19
• 1.5 研究目的和意义19-20
• 2 材料和方法20-43
• 2.1 材料20-28
• 2.1.1 NT-proBNP抗原20
• 2.1.2 实验动物与细胞株20
• 2.1.3 试剂及材料20-21
• 2.1.4 主要仪器设备21-22
• 2.1.5 主要溶液的配制22-28
• 2.2 方法28-43
• 2.2.1 NT-proBNP抗原鉴定28-30
• 2.2.2 NT-proBNP单抗的制备30-33
• 2.2.3 NT-proBNP单抗鉴定33-34
• 2.2.4 双抗体夹心ELISA方法的初步建立34-40
• 2.2.5 线性范围确定40
• 2.2.6 标准品的制备及保存40-41
• 2.2.7 检测体系的工艺研究41-43
• 3 实验结果与分析43-61
• 3.1 NT-proBNP抗原的鉴定43-44
• 3.1.1 抗原浓度的测定43
• 3.1.2 抗原纯度的测定43
• 3.1.3 抗原生物学活性鉴定43-44
• 3.2 NT-proBNP单抗的制备44-47
• 3.2.1 间接ELISA检测方法的建立44-45
• 3.2.2 免疫效价检测45
• 3.2.3 细胞融合45
• 3.2.4 细胞株稳定性测定结果45-46
• 3.2.5 腹水纯化实验结果：46-47
• 3.3 单抗的鉴定47-49
• 3.3.1 单抗表位鉴定47
• 3.3.2 单抗亚型鉴定47-48
• 3.3.3 单抗的SDS-PAGE鉴定48-49
• 3.3.4 单抗的特异性鉴定49
• 3.4 双抗体夹心法的初步建立49-57
• 3.4.1 室内质控品的建立49-50
• 3.4.2 单克隆抗体的配对50-51
• 3.4.3 包被条件的确定51-52
• 3.4.4 封闭条件的确定52
• 3.4.5 反应体系的确定52-53
• 3.4.6 反应模式的研究53
• 3.4.7 线性范围确定53-54
• 3.4.8 标准品制备及保存54-57
• 3.5 检测体系的工艺验证57-61
• 3.5.1 精密性57-58
• 3.5.2 稳定性58
• 3.5.3 回收率58-59
• 3.5.4 临床标本检测59-60
• 3.5.5 干扰因素检测60-61
• 4 讨论61-64
• 4.1 阳性细胞株的筛选61
• 4.2 抗体表位筛选61-62
• 4.3 标准品的建立及保存62-63
• 4.4 ELISA检测方法63-64
• 5 结论64-65
• 参考文献65-71
• 致谢71-73
• 个人简历73

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