长链非编码RNA linc00665-207作为CCND1的竞争性内源RNA在尼古丁诱导血管平滑肌细胞过度增殖中发挥作用

发布时间：2023-03-16 08:26

　　目的:美国40岁以上人群外周动脉狭窄的患病率为4.3%(任意一侧下肢踝肱指数<0.9),70岁以上人群患病率更高达14.5%。70%的严重下肢缺血患者接受了血管重建治疗,其中只有75%的患者下肢功能得到改善。同时,严重下肢缺血的截肢率与死亡率仍分别高达21.5%和13.5%。在已知的外周动脉疾病诸多危险因素中,吸烟是比高血压、糖尿病等更为重要的外周动脉疾病危险因素,当前吸烟者较不吸烟者外周动脉疾病风险高4.46倍。对于已经患病者来说不戒烟则往往会进展为严重的下肢缺血,需要截肢或行血管重建。作为烟草中最广为人知的有毒成分,尼古丁对血管平滑肌细胞增殖的促进作用早有报道,但其具体分子机制还有待进一步研究。细胞周期异常诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)过度增殖是导致血管闭塞性疾病发生及复发的关键。同时,越来越多研究发现非编码RNA在血管狭窄过程中发挥重要作用,而其如何调控血管平滑肌细胞增殖?其机制是否与介导细胞周期调控相关?均有待阐明。我们的前期研究发现细胞周期蛋白D(Cyclin D,CCND)与细胞G1/S期转换有关并且能够调控血管...

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【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 尼古丁上调的linc00665-207通过促进CCND1表达引起HA-VSMC过度增殖
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 材料与试剂
            2.1.1 细胞系
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 酚氯仿法总RNA提取
            2.2.2 离心柱法总RNA提取
            2.2.3 大RNA反转录
            2.2.4 茎环法miRNA反转录
            2.2.5 Real time PCR
            2.2.6 细胞培养
            2.2.7 细胞转染
            2.2.8 细菌培养
            2.2.9 质粒抽提
            2.2.10 CCK-8实验
            2.2.11 蛋白免疫印迹(Western blot)
            2.2.12 蛋白免疫印迹相关的液体配置
            2.2.13 划痕实验
            2.2.14 细胞周期检测
            2.2.15 凋亡检测
            2.2.16 琼脂糖凝胶电泳
        2.3 统计学分析
    3 实验结果
        3.1 尼古丁促进HA-VSMC中CCND1、CCND2的表达
        3.2 尼古丁促进HA-VSMC增殖和迁移、抑制HA-VSMC凋亡
        3.3 Linc00665-207参与尼古丁对HA-VSMC增殖的影响
            3.3.1 尼古丁处理上调HA-VSMC中linc00665-207表达
            3.3.2 过表达linc00665-207促进HA-VSMC增殖但不影响HA-VSMC迁移和凋亡
            3.3.3 过表达linc00665-207促进CCND1的表达但不影响CCND2的表达
    4 讨论
第二部分 尼古丁通过调控RelA上调linc00665-207表达
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 材料与试剂
            2.1.1 细胞系
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 酚氯仿法总RNA提取
            2.2.2 离心柱法总RNA提取
            2.2.3 大RNA反转录
            2.2.5 Real time PCR
            2.2.6 细胞培养
            2.2.7 细胞转染
            2.2.8 细菌培养
            2.2.9 质粒抽提
            2.2.10 CCK-8实验
            2.2.11 蛋白免疫印迹(Western blot)
            2.2.12 蛋白免疫印迹相关的液体配置
            2.2.13 染色质免疫共沉淀实验
            2.2.14 划痕实验
            2.2.15 细胞周期检测
            2.2.16 凋亡检测
            2.2.17 琼脂糖凝胶电泳
            2.2.18 双荧光素酶报告基因实验
            2.2.19 免疫细胞化学
        2.3 统计学分析
    3 实验结果
        3.1 PDGF促进HA-VSMC增殖不依赖于RelA激活和linc00665-207表达的上调
        3.2 尼古丁能够上调并激活RelA
            3.2.1 大剂量尼古丁引起高水平氧化应激
            3.2.2 低剂量(10μM)尼古丁即可上调RelA表达并促进其磷酸化和核转位
        3.3 Linc00665-207参与过表达RelA对HA-VSMC增殖的影响
            3.3.1 过表达RelA能进一步加剧尼古丁处理的HA-VSMC过度增殖和迁移能力增强同时进一步降低凋亡水平
            3.3.2 在尼古丁诱导的过度增殖HA-VSMC中过表达RelA能够进一步上调linc00665-207的表达
            3.3.3 沉默linc00665-207后能够减弱过表达RelA对CCND1的上调并减弱过表达RelA对增殖的促进作用
        3.4 尼古丁增强RelA对linc00665-207的转录激活
    4 讨论
第三部分 linc00665-207通过竞争性结合hsa-let-7a-5p调控CCND1的表达
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 材料与试剂
            2.1.1 细胞系
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 酚氯仿法总RNA提取
            2.2.2 离心柱法总RNA提取
            2.2.3 大RNA反转录
            2.2.4 茎环法miRNA反转录
            2.2.5 Real time PCR
            2.2.6 细胞培养
            2.2.7 细胞转染
            2.2.8 细菌培养
            2.2.9 质粒抽提
            2.2.10 CCK-8实验
            2.2.11 蛋白免疫印迹(Western blot)
            2.2.12 蛋白免疫印迹相关的液体配置
            2.2.13 细胞质与细胞核RNA提取
            2.2.14 RNA结合蛋白免疫共沉淀
            2.2.15 划痕实验
            2.2.16 细胞周期检测
            2.2.17 凋亡检测
            2.2.18 双荧光素酶报告基因实验
            2.2.19 琼脂糖凝胶电泳
        2.3 统计学分析
    3 实验结果
        3.1 linc00665-207作为CCND1的ceRNA与hsa-let-7a-5p相互作用
            3.1.1 尼古丁对hsa-let-7a-5p表达的影响与对linc00665-207的影响相反
            3.1.2 过表达linc00665-207下调hsa-let-7a-5p表达
            3.1.3 过表达hsa-let-7a-5p能够恢复过表达linc00665-207引起的CCND1表达上调和过度增殖
        3.2 linc00665-207作为CCND1的ceRNA与hsa-let-7a-5p相互作用
            3.2.1 生物信息学预测和核质分离PCR鉴定提示linc00665-207、hsa-let-7a-5p间潜在的ceRNA机制
            3.2.2 RIP实验和双荧光素酶报告实验证实linc00665-207和hsa-let-7a-5p的分子间直接作用
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历



本文编号：3763005