自噬在尼古丁诱导的血管内皮细胞损伤中的作用研究

发布时间：2017-06-03 12:19

  本文关键词：自噬在尼古丁诱导的血管内皮细胞损伤中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本研究以原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为对象,采用尼古丁干预,明确尼古丁刺激对人脐静脉内皮细胞自噬功能影响,探讨自噬在尼古丁诱导的内皮细胞损伤中的作用及其可能机制。方法:人脐静脉内皮细胞经不同浓度尼古丁干预6h,采用Western Blot蛋白免疫印迹技术检测细胞中自噬标记蛋白LC3Ⅱ及自噬相关蛋白Beclin-1、SQSTM1/p62和LAMP-2蛋白表达水平;Western Blot检测6×10-8M及6×10-6M尼古丁作用于HUVEC不同时间(0h、1.5h、3h、6h、12h)时LC3Ⅱ、SQSTM1/p62和LAMP-2蛋白表达变化;采用流式细胞术检测6×10-6M、6×10-8M尼古丁干预人脐静脉内皮细胞6h时的凋亡率;运用基因沉默技术敲除HUVECs中AMPKα基因,利用Western Blot技术检测LC3Ⅱ和AMPKα蛋白表达,运用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:1.不同浓度尼古丁干预HUVECs时,LC3Ⅱ蛋白表达具有浓度依赖性呈上调趋势,6×10-6M尼古丁作用下LC3Ⅱ蛋白表达显著升高(P0.01)。然而,Beclin-1表达与LC3Ⅱ的变化并不完全一致:低浓度尼古丁(6×10-9M、6×10-8M)作用下Beclin-1与对照组相比升高(P0.01),高浓度下(6×10-7M和6×10-6M)Beclin-1与对照组相比降低(P0.01)。LAMP-2蛋白表达与Beclin-1变化一致。有趣的是,SQSTM1/p62蛋白表达与Beclin-1、LAMP-2完全相反。2.6×10-8M、6×10-6M尼古丁分别干预HUVEC不同时间段,LC3Ⅱ蛋白在6h处表达水平升高显著(P0.01)。同时,6×10-6M尼古丁干预下LAMP-2表达下调明显,SQSTM1/p62蛋白表达升高显著(P0.01),然而,6×10-8M尼古丁干预下LAMP-2与SQSTM1/p62蛋白表达变化与6×10-8M尼古丁干预时相反。3.6×10-8M尼古丁处理组与对照组相比,凋亡率差异不具有统计学意义(P?0.05);6×10-6M尼古丁处理组与对照组相比,凋亡率显著升高(P0.001);6×10-6M尼古丁处理组与6×10-8M尼古丁处理组相比,凋亡率显著升高(P0.001)。4.尼古丁可磷酸化AMPKα。基因沉默AMPKα后发现,6×10-8M尼古丁+AMPKαsiRNA(AMPKsiRNA)实验组与6×10-8M(consiRNA)尼古丁实验组相比,LC3Ⅱ表达明显下调(P0.001),凋亡率显著升高(P0.001)。结论:1.尼古丁可影响人脐静脉内皮细胞自噬,具有浓度和时间依赖性。2.自噬水平升高可拮抗尼古丁诱导的内皮细胞凋亡,相反,自噬功能紊乱不利于内皮细胞存活。3.AMPK介导的自噬在抑制尼古丁诱导的内皮细胞凋亡中起关键作用。
【关键词】：自噬 尼古丁 人脐静脉内皮细胞 AMPKα LC3Ⅱ
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 常用缩写词中英文对照表11-13
• 前言13-15
• 第一部分 尼古丁对HUVEC自噬影响及自噬与凋亡关系15-33
• 1 材料与方法15-25
• 1.1 主要材料15-17
• 1.2 实验主要仪器17
• 1.3 主要实验试剂配制17-18
• 1.4 细胞培养与实验18
• 1.5 细胞总蛋白提取18-19
• 1.6 BCA法测蛋白浓度19-20
• 1.7 Western Blot实验方法20-23
• 1.8 流式细胞术23
• 1.9 统计分析23-25
• 2 结果25-30
• 2.1 不同浓度尼古丁对HUVECs自噬相关蛋白表达影响25-27
• 2.2 6×10~(-8)M尼古丁浓度下不同时间内皮细胞自噬相关蛋白表达变化影响27-28
• 2.3 6×10~(-6)M尼古丁浓度下不同时间内皮细胞自噬相关蛋白表达变化28
• 2.4 自噬增强、自噬紊乱时细胞凋亡率的变化28-30
• 3 讨论30-32
• 4 结论32-33
• 第二部分AMPK调节尼古丁诱导的自噬33-40
• 1 材料与方法33-35
• 1.1 主要试剂33
• 1.2 主要仪器33
• 1.3 AMPKα 基因沉默33-34
• 1.4 流式细胞术测HUVECs凋亡率34
• 1.5 Western Blot34
• 1.6 统计分析34-35
• 2 结果35-38
• 2.1 尼古丁可诱导AMPKα 蛋白磷酸化35
• 2.2 敲除AMPKα 后尼古丁诱导的细胞自噬及细胞凋亡率变化35-38
• 3 讨论38-39
• 4 结论39-40
• 参考文献40-43
• 综述43-55
• 参考文献50-55
• 致谢55-56
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果56-57
• 个人简历57

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  本文关键词：自噬在尼古丁诱导的血管内皮细胞损伤中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：418145