miR-21促进脐带血间充质干细胞血管向分化作用的初步研究

发布时间：2017-06-03 23:03

  本文关键词：miR-21促进脐带血间充质干细胞血管向分化作用的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的研究mi R-21促进脐带血间充质干细胞(umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells,UCBMSCs)血管向分化的作用,观察mi R-21过表达UCBMSCs在裸鼠下肢缺血模型中的血管再生效果。方法1.UCBMSCs(来源于同济大学干细胞库)培养,并通过诱导UCBMSCs成骨、成脂以及成软骨方向分化的作用,鉴定其多向分化潜能的干细胞特征;2.构建Lenti-Lacz-Luciferase和Lenti-mi R-21-Luciferase慢病毒载体,并测定其MOI值,慢病毒转染UCBMSCs后第4 d,D-荧光素钾处理细胞,通过体外生物发光成像技术(Bioluminescence Imaging,BLI)检测Luciferase表达情况,检测转染效率;3.在目的基因转染UCBMSCs后的0、1、4、7、14及28 d分别采用实时荧光定量PCR及Western Blot检测目的基因及关键成血管因子的表达;4.第3代UCBMSCs分别转染Lenti-Lacz-Luciferase和Lenti-mi R-21-Luciferase后,接种于含有Matrigel的96孔板中,分别于接种后4h至48h在显微镜下观察其tube结构形成情况,并采用Olympus Cell R imaging软件定量分析tube结构长度;5.通过结扎裸鼠股动脉及乆动脉建立下肢重度缺血(Critical limb ischemia,CLI)模型,并将UCBMSCs/mi R-21、UCBMSCs/Lacz及生理盐水各100μL分别注入臀大肌和腓肠肌,在1、4、7、14及28 d,利用热成像技术示踪移植细胞位置,激光多普勒彩超检测其血管灌注量情况。28 d获取标本,在microfil下肢血管灌注后,取臀大肌和腓肠,4%多聚甲醛固定,脱水、石蜡包埋、切片做HE以及CD31免疫荧光染色,检测新血管形成情况。结果1.UCMSCs在成骨诱导后第28天ARS染色中出现钙结节,成软骨诱导后的第16天阿辛蓝染色,成脂诱导后的第16天油红O染色均出现阳性表达,说明UCBMSCs具有多向分化能力的干细胞特性;2.慢病毒载体构建成功,其转染效率可达90%以上;3.q PCR结果表明,mi R-21组的HIF-1α和VEGF在第4天开始显著高表达,并持续到7 d和14 d。其它关键成血管因子,SDF-1、b FGF、PLGF及SCF也表现出与HIF-1α和VEGF相同趋势。Western Blot结果与q PCR结果相似;4.Matrigel结果显示在平行的三组实验中,Lenti-mi R-21-Luciferase组tube结构最多,且长度最长;5.BLI检测显示植入CLI区域的干细胞保持在植入区并未发现转移现象,荧光在第3天表达最高,并持续到第28天。激光多普勒彩超显示CLI区域血管在术后第3天,实验组的血管再生显著优于对照组,这种结果一直持续到术后28d。免疫荧光检测发现实验组CD31表达量高于Lacz组(3倍)及生理盐水组(20倍),这一结果与前期多普勒观察结果一致。结论mi R-21具有促进UCBMSCs血管向分化的作用,并对CLI有一定的治疗效果。
【关键词】：miR-21 UCBMSCs 下肢缺血 血管再生
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 英文缩略词表6-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-14
• 第一部分：人脐带血干细胞的培养以及多分化能力的鉴定慢病毒载体的构建转染效率测定14-20
• 1、材料与方法14-17
• 2、结果17-19
• 3、讨论19-20
• 第二部分：mi R-21 促进人脐带血间充质干细胞成血管分化的体外研究20-31
• 1、材料与方法20-24
• 2、结果24-29
• 3、讨论29-31
• 第三部分：mi R-21 促进UCBMSCs在裸鼠CLI体内成血管的修复作用31-37
• 1、材料与方法31-33
• 2、结果33-36
• 3、讨论36-37
• 结论37-38
• 参考文献38-44
• 附录44-45
• 致谢45-46
• 综述46-57
• 参考文献52-57

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