Zeste基因增强子同源物1,2介导miR-214抑制心肌纤维化的作用研究

发布时间：2017-06-08 22:10

  本文关键词：Zeste基因增强子同源物1,2介导miR-214抑制心肌纤维化的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目前,我国心血管疾病患病率呈快速增长趋势,估计心血管病现患病人数为2.9亿,其中心力衰竭450万人。我国每年死于心血管病约350万人,居各类疾病之首。作为心肌重构的重要方面,心肌纤维化参与多种心脏疾病的发生发展过程。长期的心肌纤维化很容易引起心力衰竭、致死性心律失常以及心脏骤停等。研究表明,缺血再灌注损伤、压力负荷、糖尿病等多种因素均能通过调节纤维化相关基因的表达,诱发心肌纤维化。心肌纤维化导致心脏僵硬度增加,心室顺应性降低,引起心功能不全,严重时甚至心衰。此外,心肌纤维化还能引起心肌细胞出现异常的电耦联活动,诱发心肌组织缺血缺氧,甚至心肌细胞的坏死等,是多种心脏疾病的重要病理基础。但是,心肌纤维化的发病机制复杂,人们对于心肌纤维化发生发展的确切分子和细胞信号转导机制还不完全清楚,尚未找到有效的干预心肌纤维化的方法。因此,进一步深入探讨心肌纤维化发生的分子机制,不仅有助于我们更好的了解疾病本身,也对心肌纤维化相关疾病的诊断、治疗以及预后判断等有重要意义。心肌纤维化是心脏受到刺激时,成纤维细胞增殖,向肌成纤维细胞表型转化,胶原蛋白尤其是Ⅰ型和Ⅲ型胶原合成增加,降解减少,导致胶原比例失调,排列紊乱,以及细胞外基质蛋白大量沉积的过程。作为心肌纤维化主要的效应细胞,肌成纤维细胞以表达α-SMA为主要标志,并分泌大量细胞因子、生长因子以及细胞外基质蛋白等,在心肌纤维化过程中起着十分关键的作用。基于目前的研究,在整体水平上,一般认为心肌纤维化的发生与肾素-血管经张素-醛固酮系统(RAAS)激活,血管内皮功能障碍及其衍生因子的内分泌失调(PCI2、ET-1等),氧化应激(ROS)和炎症,细胞内Ca2+调节失衡,调控性细胞因子(TGF-β、CTGF、PDCG等)表达增加有密切关系。在细胞和分子水平上,心肌纤维化的过程是多种刺激信号通过其受体或应力感受器,以及下游细胞内相应的信号通路传递至细胞核内,启动纤维化相关基因(包括Col I,ColⅢ, α-SMA,CTGF,MMP,Fibronectin等)表达的过程。目前已报道的调控的心肌纤维化的主要信号通路包括：TGF-β/Smad通路;MAPK/p38通路;RhoA/心肌蛋白相关转录因子(MRTF)通路；瞬时受体电位阳离子通道蛋白C6(TRPC6)/钙调神经磷酸酶(Calcineurin)通路等。这些刺激因子和信号通路之间存在着错综复杂、相互影响的关系,共同调控着心肌纤维化的发生发展进程。微小RNA (microRNAs)是一类内源性的单链非编码微小RNA,一般由18～25个核苷酸组成,可通过降解靶基因mRNA或抑制其翻译发挥生物学效应。越来越多的证据表明,多种miRNAs,如miR-1,-21,-29,-34,-199,-208等参与了心肌纤维化的发生发展进程。其中一些发挥重要作用的miRNAs有可能成为治疗心肌纤维化的新靶点。基于miRNAs基因芯片和实时定量PCR验证结果,我们选择miR-214-3p作为研究对象。文献报道,miR-214在缺血再灌注小鼠心脏中发挥了一定的心肌保护作用,而miR-214敲除小鼠出现更加严重的心肌纤维化和心功能障碍。但是目前关于miR-214-3p对心肌纤维化的作用及其分子机制尚未阐明。生物信息学分析结果提示,Zeste基因增强子同源物1,2(EZH1,EZH2)可能是miR-214-3p的靶基因。EZH1和EZH2是PcG蛋白复合体家族中多梳蛋白抑制复合体2(PRC2)的重要成员,具有组蛋白甲基化转移酶活性,是重要的转录抑制因子。它们可使靶基因启动子上组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化,促使染色质凝结和基因沉默。目前对在心肌成纤维细胞中miR-214-3p是否调控EZH1和EZH2表达尚未见报道。本文将利用Ang-Ⅱ灌注小鼠诱导心肌纤维化动物模型、Ang-Ⅱ处理心肌成纤维细胞诱导心肌纤维化细胞模型,通过双荧光报告基因实验,mimics介导过表达miR-214-3p, siRNAs介导分别沉默EZH1和EZH2表达等方法,在整体和细胞水平上明确miR-214在心肌纤维化中的作用：研究niR-214-3p是否能在转录水平调控EZH1和EZH2表达；验证上述靶基因是否介导了miR-214-3p对心肌纤维化的调控作用。本文将阐明心肌重构中miR-214-3p调控心肌纤维化的分子机制,为基于miRNAs的心肌纤维化治疗研究提供科学依据。第一章miR-214在小鼠纤维化心肌中的表达目的：建立小鼠心肌纤维化的动物模型,明确miR-214在发生重构小鼠心肌组织中的表达情况。方法：1.选取SPF级体重约20～25 g的雄性C57/BL6小鼠为实验对象,通过植入Ang-Ⅱ胶囊渗透泵(1.46 mg/kg/2w)建立心肌纤维化的动物模型。模型组和假手术组各8只；2.采用尾压法检测小鼠收缩压,并测量心脏重量与胫骨长度,计算相应比值；3.动物B超检测小鼠心肌结构与心功能相关指标；4.采用Masson三色染色对小鼠心肌组织进行胶原纤维的染色观察；5. RT-qPCR和Western-Blot分别检测小鼠心肌组织中纤维化相关基因(Collal,Co13al,a-SMA)的mRNA和蛋白表达水平；6.用miRNAs表达谱芯片检测Ang-Ⅱ灌注小鼠心肌中miRNAs的表达谱,RT-qPCR验证小鼠心肌中差异表达的miRNAs。结果：1.与生理盐水(Saline)组相比,Ang-Ⅱ灌注组小鼠收缩压明显升高,心脏重量与胫骨长度比值(HW/TL)明显高于对照组。2.动物心脏B超结果显示,与saline组比较,Ang-Ⅱ灌注组小鼠室间隔和心室壁厚度增加,左室容积变小,而反映心功能的射血分数(EF)和左室短轴缩率(FS)均显著增加。3.Masson三色染色的结果显示,比较saline组,模型组小鼠心肌组织胶原含量增加,纤维化程度加剧。4. RT-qPCR和Western-Blot的结果显示,模型组小鼠心肌中纤维化相关基因Collal, Co13al, a-SMA的mRNA和蛋白水平显著上调。5. miRNAs表达谱芯片结果显示,与Saline组相比,模型组小鼠心肌中miRNAs表达异常,经RT-qPCR验证,其中明显下调的miRNAs有miR-1,-133b,-16,-214,而miR-21表达显著上调,以miR-214在Ang-Ⅱ灌注小鼠心肌组织中下调最为显著。结论：1.与saline组相比,模型组小鼠心肌组织发生病理性心肌纤维化,说明我们通过Ang-Ⅱ灌注成功建立心肌纤维化动物模型。2.miR-214在Ang-Ⅱ灌注诱导的重构小鼠心肌中表达显著下调。第二章miR-214对小鼠心肌纤维化的影响目的：明确过表达miR-214对小鼠心肌纤维化的影响。方法：1.选取SPF级体重约20～25 g的雄性C57/BL6小鼠为实验对象,通过植入Ang-Ⅱ胶囊渗透泵(1.46 mg/kg/2w)建立心肌纤维化的动物模型。模型组和Saline组分别尾静脉注射20 nmol agomiR-214和agomiR-NC,每组各8只动物；2.测量心脏重量与胫骨长度,计算相应比值；3.动物心脏B超检测小鼠心肌结构与心功能相关指标；4.采用Masson三色染色对小鼠心肌组织进行胶原纤维的染色观察。5. Western-Blot检测小鼠心肌组织中纤维化相关蛋白(Collal,Co13al,α-SMA)表达水平。结果：1.与Saline组相比,模型组小鼠心脏重量与胫骨长度比值(HW/TL)明显增加。而与agomiR-NC组相比,agomiR-214组HW/TL值显著降低。2.动物B超结果显示,比较saline组,模型组小鼠室间隔和心室壁厚度增加,左室容积变小,而反映心功能的射血分数(EF)和左室短轴缩率(FS)均显著增加。而与agomiR-NC组相比,尾静脉注射agomiR-214显著改善Ang-Ⅱ诱导的小鼠心肌重构和心功能代偿性增强效应。3. Masson三色染色的结果显示,比较saline组,模型组小鼠心肌组织胶原含量增加,纤维化程度加剧。与agomiR-NC组相比,agomiR-214组纤维化程度降低。4. Western-Blot结果显示,比较saline组,模型组小鼠心肌组织中纤维化相关蛋白水平显著增加。与agomiR-NC组相比,agomiR-214组纤维化相关蛋白表达降低。结论：过表达miR-214可减缓Ang-Ⅱ诱导的小鼠心肌组织胶原沉积和心肌重构,并恢复心脏功能。第三章miR-214对纤维化相关基因的调控作用及其靶基因鉴定目的：明确miR-214对心肌成纤维细胞中纤维化表型的影响；对miR-214进行靶基因鉴定,并明确上述靶基因是否介导了miR-214对心肌纤维化的调控作用。方法：1.原代分离培养4 w C57/BL6小鼠心肌成纤维细胞,并通过细胞免疫荧光法检测P3代心肌成纤维细胞(CFs)中α-SMA的表达；2.免疫荧光法检测心肌成纤维细胞中纤维化相关蛋白(Collal,Col3al,α-SMA)表达水平；3.利用pGL3-promoter荧光素酶载体构建含miR-214结合位点的EZH1,EZH2基因3'UTR重组质粒以及相应的3'UTR结合位点突变的重组质粒,分别与miR-214mimic共转染HEK293T细胞,双荧光素酶报告基因实验鉴定EZH1和EZH2是否为miR-214的作用靶点；4.通过转染miR-214 mimic在CFs中过表达miR-214,RT-q PCR和Western Blot检测EZH1和EZH2的mRNA和蛋白表达水平；5.10-5M Ang-Ⅱ处理CFs 24h, Western Blot检测EZH1、EZH2、纤维化相关基因(Col1a1,Col3a1,α-SMA)水平变化；6.分别将EZH1 siRNA、EZH2 siRNA和miR-214 mimic转染CFs,RT-q PCR和Western Blot检测EZH1、EZH2、纤维化相关基因(Col1a1,Col3al,α-SMA)以及PPARy的mRNA和蛋白表达水平；7.腺病毒介导在CFs中分别过表达EZH1和EZH2,Western Blot检测EZH1、ZH2、纤维化相关基因(Collal,Col3a1,α-SMA)以及PPARy的表达水平变化；8. PPARy siRNA转染CFs, Western Blot检测纤维化相关基因(Collal, CoBa1,α-SMA)以及PPARy的表达水平变化。结果：1.P3.代心肌成纤维细胞中有特异的α-SMA表达,所培养心肌成纤维细胞的纯度达95%以上。2.转染miR-214 mimic后,心肌成纤维细胞中纤维化相关蛋白(Collal,Col3al)的表达显著降低。3.双荧光素酶报告基因实验显示在miR-214 mimic作用下,与对照组相比,miR-214与EZH1、EZH2 3'-UTR的结合能力显著增加,荧光素酶活性均显著下降。而转染诱导突变的重组质粒则不能改变荧光素酶活性。4.心肌成纤维细胞中过表达miR-214后,EZH1和EZH2的mRNA和蛋白水平均一致性的显著下调。5.EZH1和EZH2在Ang-Ⅱ诱导的心肌纤维化细胞模型中表达显著上调。6.利用siRNAs沉默心肌成纤维细胞中EZH1和EZH2表达后,纤维化相关基因(Collal, Col3al,α-SMA)的mRNA和蛋白表达水平均被抑制,而PPARγ的表达显著增加,这与在心肌成纤维细胞中过表达miR-214的作用相一致。7.在心肌成纤维细胞中过表达EZH1和EZH2后,纤维化相关基因(Collal,Col3al,α-SMA)的蛋白水平显著增加,而PPARγ的表达显著降低。8.沉默PPARγ表达后,心肌成纤维细胞中纤维化相关基因(Collal,Col3al,α-SMA)的蛋白水平显著增加。结论：1.EZH1和EZH2是miR-214的作用靶基因。2.miR-214通过在转录水平抑制EZH1和EZH2,使PPARγ表达增加,进而降低心肌成纤维细胞中纤维化相关基因的表达。全文总结：miR-214在Ang-Ⅱ灌注诱导的小鼠心肌纤维化动物模型中表达下调。尾静脉注射miR-214可减缓Ang-Ⅱ诱导的小鼠心肌组织胶原沉积和心肌重构,并恢复心脏功能。miR-214的抗心肌纤维化作用主要是通过在转录水平抑制小鼠心肌成纤维细胞中EZH1和EZH2表达,进而上调PPARγ表达,降低纤维化相关基因的表达。
【关键词】：心肌纤维化 miR-214 Zeste基因增强子同源物 细胞外基质蛋白
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.23
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-29
• 第一章 miR-214在小鼠纤维化心肌中的表达29-46
• 1 材料29-30
• 2 方法30-40
• 3 结果40-45
• 4 小结45-46
• 第二章 过表达miR-214对小鼠心肌纤维化的影响46-52
• 1 材料46-47
• 2 方法47-48
• 3 结果48-51
• 4 小结51-52
• 第三章 miR-214对纤维化相关基因表达的影响及其靶基因鉴定52-77
• 1 材料52-54
• 2 方法54-66
• 3 结果66-75
• 4 小结75-77
• 讨论77-80
• 全文总结80-82
• 参考文献82-88
• 附录88-91
• 1 本文使用的PCR引物序列88-89
• 2 缩略词89-91
• 攻读硕士学位期间成果91-92
• 致谢92-93

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