经血管周围移植骨髓间充质干细胞抑制腹主动脉瘤发展的实验研究

发布时间：2017-07-04 04:07

  本文关键词：经血管周围移植骨髓间充质干细胞抑制腹主动脉瘤发展的实验研究

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【摘要】：目的：腹主动脉瘤(Abdominal aortic aneurysm,AAA)是一种好发于老年男性的血管退行性疾病,一旦破裂,死亡率极高。腹主动脉瘤的形成包含了一个极为复杂的动脉壁病理性重建过程,其典型特征是细胞外基质(Extracellular matrix,ECM),尤其是弹性蛋白(Elastin, ELN)的合成和降解失调,以及血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)的减少。这些结缔组织的完整性受到破坏,导致动脉壁的强度减弱并发生扩张。本实验利用Pluronic F-127作为载体,将骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)移植于腹主动脉周围,研究其对腹主动脉瘤发展的影响。方法：本课题组采取全骨髓贴壁的方法分离骨髓间充质干细胞,并进行体外扩增、纯化,采取流式细胞术和三系分化对细胞进行鉴定。将实验动物分为三组：假手术组(SHAM)、对照组(CG)、实验组(EG),对照组和实验组均通过胰弹性蛋白酶灌注的方法建立大鼠腹主动脉瘤模型,用Ⅰ型猪胰弹力蛋白酶持续加压灌注肾下腹主动脉,保持灌注时间30mmin。实验组在造模后将外源性BMSC和Pluronic F-127凝胶混合,均匀外敷于腹主动脉周围。4周后获取组织样本,通过大体观察和测量血管直径观察大鼠组织结构的变化；通过间苯二酚染色观察各组大鼠弹力纤维的形态；通过平滑肌肌动蛋白(Alpha smooth muscle actin,α-SMA)免疫组织化学染色法确定主动脉壁内血管平滑肌细胞的存留情况；通过real-time PCR分析各组大鼠动脉壁内基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases,MMP-9)和金属蛋白酶组织抑制剂-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP-1)的表达情况。结果：体外培养的细胞阳性表达CD29、90,而阴性表达CD45、34,且经成骨、成脂和成软骨诱导后,茜素红、油红、阿辛蓝染色均呈阳性,从而证实实验细胞为骨髓间充质干细胞。采用胰酶灌注法进行造模后,腹主动脉的直径较原来增加超过50%,符合腹主动脉瘤的诊断标准。4周后进行各项检测结果表明,经过BMSC治疗的实验组与对照组相比,动脉瘤的扩张率明显减轻(53.13+30.83% VS 139.37+27.45%,P0.01),提示实验组动脉瘤的发展受到明显的抑制；MMP-9的mRNA相对表达水平降低(1.34±0.14 VS 2.4±0.14,P0.01),而TIMP-1的mRNA相对表达水平升高(0.76±0.18 VS 0.48±0.17,P0.01),提示实验组动脉瘤体中MMP的活性受到明显抑制,而其组织抑制剂的活性增强；存留的血管平滑肌细胞数量明显增多(88.1±8.63 VS 48.43+9.03个/高倍镜,P0.01)，，提示实验组血管壁中较少的平滑肌细胞发生凋亡。结论：采用胰弹性蛋白酶灌注法可以建立稳定的大鼠腹主动脉瘤模型。本课题组证明了以Pluronic F-127为载体,将BMSC移植于腹主动脉瘤周围,可以通过降低血管壁中MMP的活性,使弹性蛋白降解减少,且能使较多的血管平滑肌细胞得到留存,从而成功延缓了腹主动脉瘤的发展。本实验为如何抑制腹主动脉瘤的发展提供了新的思路,并为腹主动脉瘤的进一步治疗提供了理论依据。
【关键词】：腹主动脉瘤 间充质干细胞 Pluronic F-127 血管平滑肌细胞 MMP
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.16
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-11
• 中英文缩略词表11-12
• 前言12-14
• 综述：腹主动脉瘤的研究进展14-21
• 第一章：材料和方法21-30
• 1. BMSC的体外培养和鉴定21-23
• 1.1 实验材料和仪器21
• 1.2 细胞制备及培养21-22
• 1.3 流式细胞术鉴定表面抗原22
• 1.4 BMSC的三系分化22-23
• 2. 弹性蛋白酶诱导大鼠肾下型腹主动脉瘤模型的建立23-24
• 2.1 实验材料23-24
• 2.2 实验方法24
• 2.3 评价标准24
• 3. BMSC对腹主动脉瘤的影响24-29
• 3.1 实验分组24-25
• 3.2 标本采集25-29
• 3.2.1 实验器材25
• 3.2.2 实验试剂25
• 3.2.3 标本采集25-26
• 3.2.4 石蜡包埋26
• 3.2.5 间苯二酚染色26
• 3.2.6 石蜡切片免疫组化染色26-27
• 3.2.7 Real-time PCR检测27-29
• 4. 统计学分析29-30
• 第二章：实验结果30-36
• 2.1 BMSCs的免疫表型鉴定30-31
• 2.2 成骨、成脂、成软骨分化31-32
• 2.3 腹主动脉瘤形态学观察32-33
• 2.4 动脉弹力纤维染色33-34
• 2.5 MMP-9、TIMP-1的基因表达34-35
• 2.6 血管平滑肌细胞的数量35-36
• 第三章：讨论36-42
• 第四章：结论42-43
• 致谢43-44
• 参考文献44-51
• 作者简介51

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