吲哚胺2,3双加氧酶调节血管平滑肌细胞表型转换的体外研究

发布时间：2017-08-08 11:20

  本文关键词：吲哚胺2,3双加氧酶调节血管平滑肌细胞表型转换的体外研究

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【摘要】：目的：为探索吲哚胺2,3双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)及其代谢微环境(低色氨酸及色氨酸代谢产物堆积)在动脉硬化闭塞症(atherosclerotic occlusive, ASO)、经皮动脉腔内血管成形术(percutaneous transluminal angioplasty, PTA)及支架植入术后再狭窄(restenosis, RS)等病理过程中的作用,本实验研究其体外对血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscular Cell, VSMC)增殖及表型转换的影响。方法：采用血管环翻转贴壁法原代培养小鼠主动脉平滑肌细胞(SMCs),并对其进行平滑肌α-肌动蛋白(SM α-actin)免疫细胞化学法(immunocyto-chemistry, ICC)鉴定；应用低色氨酸(Low-tryptophan, L-Trp)及其代谢产物犬尿氨酸(Kynurenine, KYN)培养并观察对其增殖能力及表型基因表达的影响；通过与高表达IDO的小鼠血管瘤内皮细胞(EOMA, ATCC(?) CRL-2586TM)联合培养,利用MTT法检测其增殖情况,并应用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantified real time PCR, qRT-PCR)检测其表型基因的表达水平上的差异。使用SPSS 19.0软件包进行数据分析。结果：经上述方法体外培养主动脉SMCs,5-10天可有细胞萌出,每取材2只小鼠可获得约6×105个二代SMCs,传至第三代时细胞生长呈典型的“峰”和“谷”形态,经SM α-actin免疫组化鉴定呈阳性(棕色),细胞纯度达95%以上。3-10代细胞增殖旺盛,形态典型,细胞传代至10-12代以后细胞形态变化较大,生长缓慢,凋亡增多。取3-5代SMCs用于后续实验。L-Trp可以较为明显抑制SMCs的增殖,但其代谢产物KYN则只有在高浓度下才会对SMCs的增殖产生抑制作用,而且这种抑制作用在培养96小时后才会表现出来,qRT-PCR显示：在120小时的培养时间内,无论是L-Trp还是KYN培养均未对SMCs收缩表型基因Smoothelin-B的表达产生显著影响,单纯KYN (200 μM)培养对合成表型基因Syndecan-1的表达亦未产生明显影响,而只有L-Trp (10μM)及L-Trp+KYN联合培养组在培养72h、96h、120h时Syndecan-1的表达显著下调。考虑可能是单纯色氨酸饥饿环境产生的影响,而代谢产物KYN (200 μM)并不能显著影响此两种表型基因的表达。SMCs与高表达小鼠IDO的EOMA共培养后96h、120h后,SMCs的增殖受到抑制,而添加IDO特异性抑制剂1-mT(1-methyl tryptophan,1-甲基色氨酸)后这种抑制作用消失,提示IDO对SMCs的增殖产生抑制作用。qRT-PCR结果提示平滑肌细胞Smoothelin-B在与EOMAIDO+共培养96h、120h后表达显著上调,Syndecan-1则在共培养120h后表达下调,添加1-mT后这种效应被削弱。结论：采用改良的血管环翻转贴壁法能获得高纯度的SMCs,简单易行,且有效避免了外膜成纤维细胞及内膜内皮细胞的污染。可为实验研究提供细胞材料。低色氨酸(10μM)可抑制平滑肌细胞的增殖,而其代谢产物KYN只有在高浓度(200μ M)下才产生这种抑制作用,不认为两者对SMCs的表型转换有明显影响。IDO可抑制SMCs的增殖及去分化,促进SMCs向收缩型转换,尚不能认为这种效应由色氨酸饥饿及其代谢产物聚集所引起,可能存在其他作用机制尚待研究。
【关键词】：低色氨酸 犬尿氨酸 吲哚氨2 3双加氧酶 血管平滑肌细胞 增值表型转换
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 符号说明10-11
• 前言11-15
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-14
• 实验流程图14-15
• 一、原代培养小鼠主动脉平滑肌细胞15-26
• 1.1 实验对象和方法15-19
• 1.1.1 实验动物15
• 1.1.2 主要试验仪器15
• 1.1.3 主要试剂15-16
• 1.1.4 原代培养小鼠血管平滑肌细胞16-17
• 1.1.5 细胞消化传代及纯化17
• 1.1.6 免疫组化鉴定及细胞纯度17-18
• 1.1.7 细胞计数及活力检测18
• 1.1.8 细胞冻存与复苏18-19
• 1.1.9 生长曲线19
• 1.2 结果19-20
• 1.2.1 细胞形态学观察19-20
• 1.2.2 传代及活力20
• 1.2.3 生长曲线20
• 1.2.4 免疫组化20
• 1.3 讨论20-22
• 1.4 小结22-23
• 附图23-26
• 二、体外IDO对平滑肌细胞增殖及表型转换的影响26-47
• 2.1 对象和方法26-39
• 2.1.1 实验材料与仪器26-27
• 2.1.2 L-TRP及其代谢产物KYN培养SMCs27-28
• 2.1.3 高表达IDO的EOMA对SMCs的影响28-33
• 2.1.4 MTT检测SMCs增殖33
• 2.1.5 qRT-PCR检测其表型基因表达33-38
• 2.1.6 统计学分析数据38-39
• 2.2 结果39-44
• 2.2.1 MTT检测VSMC增殖情况39-40
• 2.2.2 qRT-PCR检测其表型基因表达40-44
• 2.3 讨论44-46
• 2.4 小结46-47
• 结论47-48
• 参考文献48-51
• 发表论文和参加科研情况说明51-52
• 附录52-59
• 综述59-73
• 参考文献68-73
• 致谢73

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 李永光;朱伟;陆志刚;魏盟;;STAT3在血管平滑肌细胞中的作用及其机制的最新进展[J];上海医学;2014年07期

2 韩博;徐三荣;张进;周庆;李伟;;同基因与异基因胚胎肝干细胞移植治疗小鼠肝硬化[J];中国组织工程研究;2013年36期

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1 张沛;SOCS3在心脏移植慢性排斥反应中的作用和机制研究[D];华中科技大学;2014年

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1 邱梅红;肺动脉高压大鼠心室间糖酵解代谢相关基因筛选和差异[D];吉林大学;2014年

2 吕慧彦;外周血中S100A4蛋白水平与肺腺癌、肺鳞癌的相关性分析[D];大连医科大学;2014年

3 朱丽娟;食管鳞状细胞癌组织中S100A11、14-3-3、Gstp和HnRNPA2/B1的表达及其临床意义的研究[D];新疆医科大学;2014年

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本文编号：639724