HCMV感染内皮细胞来源的外泌体对血管平滑肌细胞功能影响的初步研究

发布时间：2017-08-11 10:28

  本文关键词：HCMV感染内皮细胞来源的外泌体对血管平滑肌细胞功能影响的初步研究

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【摘要】：目的:验证超速离心法、蔗糖梯度离心法提取HCMV感染的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)上清中外泌体(exosomes)的效率。分析来源于HCMV感染HUVEC来源的exosomes中是否含有差异表达的miRNAs,进一步观察该exosomes能否与人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)通信并影响其迁移功能。方法:(1)选用HCMV-AD169实验室株及HUVEC原代细胞株,体外模拟HCMV的活动性感染状态。实验共分3组:①实验组,吸附感染法接种5TCID50活性HCMV-AD169;②阴性对照组,吸附感染法接种等量经紫外线(ultraviolet,UV)灭活的HCMV-AD169;③空白对照组,吸附感染法相同步骤模拟接种同等体积DMEM液。当实验组细胞病变效应(CytopathicEffect,CPE)达到约90%时,3组同时更换培养液,并继续培养2～3天后同时收集细胞上清。采用超速离心法及蔗糖梯度离心法提取上清中exosomes。分别以透射电镜验证exosomes形态、直径,westem-blot验证exosomes膜表面标志蛋白CD9。(2)EXO-quick试剂盒法提取3组上清中的exosomes,用IlluminaHiSeqTM2500平台对其miRNAs进行测序,并分析是否具有差异表达的miRNAs。(3)体外培养HASMC,分别与3组离心提取的exosomes共培养,以划痕实验及transwell实验检测exosomes与HASMC的通讯作用及对其迁移能力的影响。结果:(1)超速离心、蔗糖梯度离心所得粒子透射电镜下检测显示,粒子直径处于30～100 nm间且具有典型"杯托"样外观。并且,Western blot检测证实表达CD9膜蛋白。证实超速离心、蔗糖梯度离心所得粒子即为exosomes。(2)exosomes测序结果显示:实验组与空白对照组间共有28对miRNAs表达量差异具有统计学意义,实验组与阴性对照组间共17对miRNAs表达量差异具有统计学意义,阴性对照组与空白对照组间仅3对miRNAs表达量差异具有统计学意义(fold chang2,p0.05)。回顾文献发现,部分差异表达miRNAs已被证实可能与心血管疾病有关,如miR-96、miR-3960、miR-221等。(3)与对照组相比,实验组能显著促进HASMC的迁移能力,差异具有统计学意义(p0.05);而阴性对照组与空白对照组间差异不具有统计学意义(p0.05)。结论:(1)超速离心及蔗糖离心法能有效提取exosomes。(2)来源于HCMV感染HUVEC的exosomes所含miRNAs存在差异表达。(3)来源于HCMV感染HUVEC的exosomes能与HASMC通信,并促进其迁移功能。
【关键词】：人脐静脉内皮细胞 血管平滑肌细胞 人巨细胞病毒 外泌体 miRNA 超速离心 蔗糖梯度离心
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 主要英文缩写表9-10
• 前言10-13
• 材料与方法13-28
• 一、实验设计13
• 二、主要材料和试剂、仪器13-16
• 三、实验方法16-27
• 四、统计学方法27-28
• 结果28-41
• 一、细胞模型建立结果28-36
• 二、exosomes鉴定、测序分析结果36-40
• 三、实验组exosomes促进HASMC迁移功能40-41
• 讨论41-45
• 结论45-46
• 参考文献46-50
• 综述50-58
• 参考文献54-58
• 攻读硕士学位期间已发表论文58-59
• 致谢59

【参考文献】

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1 Rosa Sessa;Marisa Di Pietro;Simone Filardo;Ombretta Turriziani;;Infectious burden and atherosclerosis: A clinical issue[J];World Journal of Clinical Cases;2014年07期

2 景录先;;如何防控心脑血管疾病[J];中国中医药现代远程教育;2006年03期

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本文编号：655619