冠状动脉粥样硬化斑块形成相关的靶点基因的探索及其功能与机制的研究

发布时间：2017-08-18 19:34

  本文关键词：冠状动脉粥样硬化斑块形成相关的靶点基因的探索及其功能与机制的研究

  更多相关文章： 白细胞介素增强结合因子3 巨噬细胞 细胞因子 核因子-κb 丝裂原激活的蛋白激酶

【摘要】：研究背景及目的：冠状动脉粥样硬化性心脏病是由多种原因引起的常见疾病,近年其发病率在不断上升。冠状动脉内粥样硬化斑块的形成及其破裂和血栓形成,是引起急性心血管事件的主要原因。目前除了对肥胖,吸烟,高血压,糖尿病,高脂血症等传统的危险因素的研究外,人们对冠状动脉粥样硬化斑块形成相关的靶点基因的研究越来越重视。肌细胞增强因子2A(MEF2A)基因是第一个被发现的引起冠状动脉性心脏病CHD和心肌梗死MI的致病基因,随后越来越多的关于MEF2A基因突变所致的冠状动脉粥样硬化性心脏病的研究出现。我们对一有家族性冠心病发病现象的家庭进行了调查,发现该家族患病成员均有MEF2A基因第11外显子"CAGCCG"六个碱基的缺失。MEF2A基因功能的异常导致了CHD和MI的发生。炎症参与动脉粥样硬化斑块形成和发展过程,可诱导分泌多种细胞因子,如TNF-α, IL-6等。巨噬细胞在调节动脉粥样硬化斑块内炎症方面起着至关重要的作用。经典活化激活的巨噬细胞(M1)促进炎症的发展,替代活化激活的巨噬细胞(M2)抑制炎症发展。通过调控巨噬细胞功能可以改善动脉粥样硬化斑块的形成和进展。精氨酸酶-1(Arg-1)能促进平滑肌细胞增殖并抑制炎症,高表达于M2型巨噬细胞,能抑制巨噬细胞炎症反应,减少肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的生成和单核细胞的趋化迁移,还能减弱动脉粥样硬化斑块内的炎症反应从而稳定斑块,我们之前的研究已充分证实Arg-1在冠状动脉粥样硬化斑块中的作用。通过对Arg-1上游调控基因的探索,可以发现与动脉粥样硬化相关的新的调控基因,通过新基因的探索及对其功能的研究可以找到新的冠心病干预靶点,对疾病的研究具有重要意义。在上述研究的基础上,我们提出如下假设：(1)筛选与精氨酸酶1启动子活性区域结合的转录因子,以发现与MEF2A调控冠状动脉粥样硬化斑块形成类似的新的靶点基因。(2)探讨新发现的靶点基因在动脉粥样硬化斑块炎症反应中的作用及机制。本研究基于发现MEF2A基因功能异常导致家族性冠状动脉粥样硬化性心脏病的研究,以之前对Arg-1的研究为基础。旨在探索调控斑块炎症反应的新靶点基因,验证并明确白细胞介素增强结合因子3(Interleukin enhancer-binding factor 3, ILF-3)为Arg-1的转录因子,并对其功能进行研究,以期找到与冠状动脉粥样硬化斑块炎症相关的新预防和治疗靶点。方法：1.细胞处理：以脂多糖(LPS)作为炎症诱导剂,以干扰素γ(IFN-γ)+LPS和白细胞介素4(IL-4)作为巨噬细胞极化分型诱导剂,分别对细胞进行处理。2. pGL3载体的构建：应用逐段删除法进行引物设计,PCR扩增得到-560 bp,-510 bp,-460 bp,-410 bp,-360 bp,-310 bp,-260 bp带有Arg-1启动子片断的Pgl3-basic多克隆载体。3.细胞转染：用Arg1-Pgl3质粒转染平滑肌细胞,Arg1-siRNA转染平滑肌细胞,慢病毒转染小鼠细胞系Raw264.7细胞,转染完成后进行下一步实验或检测。4.荧光素酶活性的检测：制备细胞裂解液,按照荧光素酶试剂盒说明书处理并及时用光度计进行检测,检测出高荧光素酶活性片段。5.Arg-1-460bp至-410 bp启动子区域结合蛋白的纯化和分析鉴定：应用DNA结合蛋白纯化试剂盒,纯化Arg-1-460 bp至-410 bp启动子区域的结合蛋白,经胰蛋白酶消化和脱盐处理后送公司检进行蛋白质分析检测,分析活性区域的结合蛋白。6.染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP):按试剂盒说明书操作,验证ILF-3是否与Arg-1启动子的活性片段直接结合。7.荧光实时定量RT-PCR检测：提取细胞总RNA,检测ILF-3, Arg-1及细胞炎性因子mRNA的表达。8. Western blot检测：提取细胞总蛋白,检测β-actin, GAPDH, ILF-3, Arg-1, IL-10, TNF-α, IL-6, P38/phospho-P38, JNK/phospho-JNK, ERK/phospho-ERK,核因子-κb(NF-κB)P65的蛋白表达。9.组织免疫化学分析：对人冠状动脉粥样硬化斑块石蜡切片进行免疫化学染色,观察ILF-3在斑块中的分布。10.免疫荧光实验分析：用免疫荧光染色及激光共聚焦技术,观察ILF-3在巨噬细胞中的定位,以及观察ILF-3和Arg-1在人冠状动脉和冠脉粥样硬化斑块中的定位。研究结果：1.ILF-3直接结合于Arg-1启动子的-460bp到-410bp区域并调节精氨酸酶1转录过程。经液相质谱仪分析ILF-3结合于Arg-1启动子上,经ChIP验证确定ILF-3可直接结合于Arg-1启动子,使用ILF-3小干扰RNA抑制ILF-3的蛋白表达后精氨酸酶1mRNA水平和蛋白质水平均下降了70%(p0.01)。2.Raw 264.7细胞中ILF-3和炎性因子在LPS诱导下的时间和剂量依赖性表达。随着LPS剂量的增加,ILF-3蛋白质的表达开始时增加达到峰值然后减少,在1000ng/ml时出现了下降的趋势。随着LPS刺激时间的延长,ILF-3表达量在2 h开始增加,在4 h达到顶峰。随后ILF-3表达开始下降直到第72 h。Arg-1的表达量在2 h增加,12 h达顶峰,IL-10在4 h达到顶峰,之后Arg-1和IL-10都开始下降。3.ILF-3在巨噬细胞和动脉粥样硬化斑块中的表达。在Raw 264.7细胞中,ILF-3主要分布在细胞核,特别是核仁。Western blot和激光共焦显微镜的结果表明ILF-3在M1型巨噬细胞低表达,在M2型巨噬细胞中高表达。在动脉粥样硬化斑块中,ILF-3在斑块中高表达并且主要集中在巨噬细胞中,对ILF-3和Arg-1免疫荧光双标显示ILF-3和Arg-1共同表达于人冠状动脉粥样硬化斑块中,并有共定位现象,两者都在巨噬细胞高表达。4.过表达ILF-3抑制巨噬细胞中LPS诱导的炎性因子并上调抗炎细胞因子。LPS诱导增加了TNF-a, IL-6和1L-1p表达水平,过表达ILF-3后TNF-a IL-6和IL-1β明显减少,而1L-10和Arg-1表达量与LPS组相比增加了。在过表达ILF-3但未用LPS刺激时,PCR和Western blot结果显示Arg-1和IL-10表达同样显著增加。5.过表达ILF-3抑制丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK) 和 NF-κ B信号通路的激活。与未作处理细胞相比,LPS可以增加p-P38, p-JNK, p-ERK,和P65的蛋白表达。ILF-3过表达显著减弱LPS诱导的P65及磷酸化P38和JNK的表达,但没有减少p-ERK的表达。结果表明,ILF-3参与LPS诱导NF-κB和MAPK信号通路调节过程。结论及意义：1. ILF-3为Arg-1的转录因子,调控Arg-1的转录,为冠状动脉粥样硬化性斑块炎症相关的新的靶点基因。2. ILF-3高表达于M2型巨噬细胞,能增强M2型巨噬细胞功能。3.ILF-3抑制LPS诱导的巨噬细胞炎性因子的分泌并促进抗炎因子的分泌。4.ILF-3的抑炎作用是通过抑制p-P38/MAPK, p-JNK/MAPK和NF-Kb信号通路来实现的。5.我们筛选出了Arg-1的转录因子ILF-3,并对ILF-3在冠状动脉粥样硬化斑块以及巨噬细胞中的分布以及细胞炎性因子分泌中的作用和机制进行了系统研究,ILF-3很可能会成为与冠状动脉粥样硬化炎症相关的新预防和治疗靶点,对冠状动脉粥样硬化性心脏病的研究具有重要意义。
【关键词】：白细胞介素增强结合因子3 巨噬细胞 细胞因子 核因子-κb 丝裂原激活的蛋白激酶
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.4
【目录】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 英文对照缩略表15-17
• 前言17-20
• 材料与方法20-31
• 结果31-35
• 讨论35-39
• 实验结论39-40
• 附图40-51
• 参考文献51-57
• 文献综述57-65
• 参考文献59-65
• 致谢65-66
• 攻读学位期间发表论文66-67
• 学位论文评阅及答辩情况表67

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本文编号：696424