微管解聚对心肌细胞电生理特性的影响及微管定量分析方法研究

发布时间：2017-08-20 21:14

  本文关键词：微管解聚对心肌细胞电生理特性的影响及微管定量分析方法研究

  更多相关文章： 心肌细胞 缺氧 微管 电生理 灰度直方图

【摘要】：微管是心肌细胞的主要骨架成分,参与维持细胞形态等一系列重要生理活动。“休克心”理论认为,在严重烧伤引发的心功能损害中,缺氧导致的微管解聚至关重要。然而,微管解聚对作为心肌细胞活性与功能基础的电生理方面的作用一直缺乏系统的研究和观察。另外,高度动态平衡的微管系统的研究一直依赖于显微成像技术,这种传统的方法存在观察者主观偏差等致命缺陷。因此,探讨可客观量化微管形态变化的新方法将为缺氧引起的微管解聚带来新的认识。本研究以大鼠乳鼠心肌细胞作为研究对象,利用固定浓度、固定时间的秋水仙碱处理模拟特定缺氧环境下微管解聚的效应。将上述微管解聚效应作为单一实验因素来观察大鼠乳鼠心肌细胞各项电生理指标变化,以分析单纯微管解聚所引起的电生理特性改变及机制。同时,基于标记微管形态的H9C2心肌细胞荧光图像,用灰度直方图(GLH)特征参数比较量化了秋水仙碱和缺氧引起微管解聚后微管形态变化,以进一步明确两者的对照关系。一、材料与方法1.体外SD大鼠乳鼠心肌细胞分离培养,分为正常对照组和微管解聚组。观察秋水仙碱处理后微管变化:免疫荧光染色标记α微管蛋白,激光共聚焦显微镜下观察微管形态变化;蛋白免疫印迹(WB)实验检测游离/聚合态α微管蛋白的含量变化。2.体外SD大鼠乳鼠心肌细胞分离培养,分为正常对照组和微管解聚组。观察秋水仙碱处理后电生理特性及耗氧量变化:倒置显微镜下实时录制自主搏动以计算其搏动频率;全细胞膜片钳技术记录心肌细胞动作电位(AP)、延迟整流型钾离子通道电流(IK)和L型钙离子通道电流(ICa-L);氧微电极系统测定培养液中溶解氧浓度,间接反应心肌细胞耗氧量。3.H9C2心肌细胞培养,分为正常对照组、缺氧组和秋水仙碱组。基于荧光标记微管的数字图像进行定量分析:α微管蛋白免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜获取微管数字图像,Matlab7.0等软件进行单细胞分割、去噪、等比例分区等处理并提取GLH特征参数。二、主要结果1.正常对照组乳鼠心肌细胞微管呈现线性管状形态,结构清晰完整,以核周为中心放射状分布。微管解聚组细胞微管卷曲,念珠样改变,结构遭破坏而断裂,呈弥漫性分布,荧光强度也降低。微管解聚组聚合态微管蛋白含量降低,游离态微管蛋白含量增高。2.微管解聚后乳鼠心肌细胞较正常对照组自主搏动频率明显升高,耗氧量也相应增加。3.微管解聚组乳鼠心肌细胞AP形态发生明显变化,复极化平台期不明显,动作电位时程(APD)明显缩短,静息电位(RP)和动作电位振幅(AMP)未见明显变化。4.微管解聚组乳鼠心肌细胞IK电流增强,其I-V曲线较正常对照组上移,激活后各测试电压下(0-40mV)IK电流密度峰值均增加;然而,ICa-L电流未见变化,其I-V曲线与正常对照组基本重叠,激活后各测试电压下(-30-50mV)ICa-L电流密度峰值无明显改变。5.与正常对照组相比,缺氧组和秋水仙碱组H9C2心肌细胞微管形态量化参数呈类似的变化趋势;且两组均是在与细胞膜连接的正端更明显。三、结论1.微管解聚后IK增强,ICa-L电流不变,使得AP复极化增快,进而缩短APD,增快心肌细胞自主搏动频率,增加其耗氧量,这可能是造成或加重心肌缺氧损害的重要因素。2.基于荧光图像,以GLH特征参数(均值,方差,偏度,峰度,能量,熵)量化微管形态是切实可行的。该方法证实:缺氧及秋水仙碱处理后心肌细胞整体及区域内微管形态量化特征相类似,存在对照关系。微管荧光图像形态学灰度分析法能更加准确地分析判断缺氧心肌细胞微管的变化及其程度,具有较大意义。
【关键词】：心肌细胞 缺氧 微管 电生理 灰度直方图
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 英文缩写一览表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-10
• 第一章 前言10-12
• 第二章 微管解聚对大鼠乳鼠心肌细胞电生理特性的影响12-32
• 2.1 材料与方法12-24
• 2.2 结果24-30
• 2.3 讨论30-31
• 2.4 小结31-32
• 第三章 基于荧光图像的心肌细胞微管定量分析32-46
• 3.1 材料与方法32-39
• 3.2 结果39-44
• 3.3 讨论44-45
• 3.4 小结45-46
• 全文结论46-47
• 参考文献47-50
• 文献综述一 微管影响心肌细胞离子通道活动50-57
• 参考文献54-57
• 文献综述二 基于图像的微管定量分析57-62
• 参考文献60-62
• 附录62-65
• 攻读硕士学位期间发表的文章65-66
• 致谢66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 姚宇华,熊江辉,梁仲刚,严洪,李莹辉;心肌细胞微管图像的灰度特征分析(英文)[J];航天医学与医学工程;2004年05期

2 王吉林;赵力;;数字图像形状特征提取的研究[J];微电子学与计算机;2010年05期

3 邝勇;黄跃生;;缺氧早期大鼠心肌细胞微管损害的观察[J];中华烧伤杂志;2007年03期

，

本文编号：708910