CTRP9对巨噬细胞炎症因子表达的影响及机制研究

发布时间：2017-08-24 01:31

  本文关键词：CTRP9对巨噬细胞炎症因子表达的影响及机制研究

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【摘要】：1研究背景动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)是我国及世界范围内致死、致残的首要原因,且其发病率、死亡率仍处于增长趋势。ASCVD的病理基础是动脉粥样硬化(AS),迄今为止,其病理生理机制仍未被完全揭示。众多证据表明AS是脂质代谢紊乱和炎症性血管疾病。斑块内脂质代谢紊乱和炎症反应这两个病理因素互相影响,促进AS进展。其中,巨噬细胞在AS中扮演着重要的角色。荷脂的巨噬细胞产生并释放大量的炎性细胞因子,参与AS发生发展的各个阶段。因此,抑制斑块内巨噬细胞炎症反应对延缓AS的发生发展具有重要意义。C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9 (CTRP9)是近年发现的新型脂肪细胞因子,隶属于C1q肿瘤坏死因子超家族(Clq/TNF-related proteins, CTRPs)。目前研究显示,CTRP9在调节代谢、保护心肌、改善内皮功能及抵抗糖尿病心血管损害等方面发挥重要作用。本课题组前期研究显示,CTRP9可增加动脉粥样硬化斑块稳定性并抑制斑块内巨噬细胞炎症反应。然而,CTRP9抑制巨噬细胞炎症反应的机制尚不明确。因此,本研究将对CTRP9对巨噬细胞炎症因子的表达和机制进行深入探讨。2研究目的(1)研究CTRP9对巨噬细胞炎症因子表达的影响；(2)探讨CTRP9在巨噬细胞炎症反应中的作用机制。3材料和方法3.1细胞培养与处理(1)以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究对象。将细胞以DMEM+10%胎牛血清+1%双抗配制成的完全培养基于37℃、50%CO2的细胞培养箱中进行培养。(2)实验采用浓度为100ug/ml的氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激巨噬细胞建立炎症模型。实验以CTRP9球状结构域重组蛋白(gCTRP9)预处理细胞,在完全培养基或oxLDL刺激下,检测相关因子的表达差异。3.2 Real-time PCR提取各组细胞mRNA。检测炎症因子TNF-α、MCP-1的mRNA水平。3.3 Western blot提取各组细胞总蛋白和／或核蛋白。检测TNF-α、MCP-1、NF-κB、AMPK、 AdipoR1的表达。3.4细胞免疫荧光制作各组细胞爬片。激光共聚焦显微镜下观察TNF-α、MCP-1及AdipoRl的表达以及NF-κB的核转位情况。3.5 AdipoRl siRNA转染筛选出抑制效果最优的AdipoRl siRNA序列。以Lipo2000转染巨噬细胞后,用于后续实验。3.6统计学分析以SPSS 13.0进行统计学分析,所有数据均用均数±标准差表示。以单因素方差分析(ANOVA)进行多组间统计分析。P0.05被认为差异具有统计学意义。4结果4.1 CTRP9可抑制巨噬细胞炎症因子的表达Western blot结果显示,与对照组比较,oxLDL可增加炎症因子TNF-α和MCP-1的表达(p0.05)；与oxLDL组相比,gCTRP9可浓度依赖性地降低TNF-α和MCP-1的表达(p0.05)。同时,RT-PCR和激光共聚焦成像结果显示,gCTRP9可显著抑制oxLDL诱导的TNF-α和MCP-1的mRNA和蛋白的表达(p0.05)。4.2 CTRP9可抑制巨噬细胞NF-κB的活化Western blot结果显示,与对照组比较,oxLDL可提高NF-κB的磷酸化水平(p0.05)；与oxLDL组相比,gCTRP9可显著降低NF-κB的磷酸化水平(p0.05)。Western blot及激光共聚焦成像显示,跟对照组相比,oxLDL可促进NF-κB的核转位(p0.05),而gCTRP9可抑制oLDL诱导的细胞核NF-κB的表达(p0.05)。4.3 CTRP9在巨噬细胞中的抗炎作用依赖于AMPK磷酸化Western blot结果显示,gCTRP9可明显提高AMPK的磷酸化水平(p0.05)；而AMPK的抑制剂Compound C (Com C)显著抑制gCTRP9引起的AMPK的磷酸化(p0.05)。 Western blot结果显示,与gCTRP9+oxLDL组比较,Com C取消了gCTRP9对炎症因子TNF-α和MCP-1的抑制效果(p0.05)；与gCTRP9+oxLDL组比较,Com C取消了gCTRP9对NF-κB的抑制效果(p0.05)。4.4 AdipoR1介导了CTRP9在巨噬细胞中的抗炎作用Western blot结果显示,与对照组比较,oxLDL不影响AdipoR1的表达；与oxLDL组比较,gCTRP9可增加AdipoR1的表达(p0.05)；同时,激光共聚焦成像结果显示,与oxLDL组比较,gCTRP9可显著增加细胞膜表面AdipoR1的表达(p0.05)。Western blot结果显示,与对照组相比,AdipoR1 siRNA可抑制gCTRP9引起的AMPK磷酸化(p0.05)；与对照组比较,AdipoR1 siRNA取消了gCTRP9对炎症因子TNF-α和MCP-1的抑制效果(p0.05)。5结论(1) CTRP9可以增加巨噬细胞AdipoR1的表达水平；(2) CTRP9可以通过AdipoR1/AMPK/NF-κB通路抑制巨噬细胞炎症反应。
【关键词】：C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白9 炎症 巨噬细胞 腺苷酸活化蛋白激酶 脂联素受体1
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-15
• 前言15-18
• 材料与方法18-37
• 实验结果37-40
• 讨论40-43
• 创新点和限制性43-44
• 结论44-45
• 附图45-50
• 参考文献50-54
• 致谢54-55
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文55-56
• 学位论文评阅及答辩情况表56

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本文编号：728447