Id1和MT-MMPs在切应力调控血管新生过程中的作用

发布时间：2017-08-26 04:07

  本文关键词：Id1和MT-MMPs在切应力调控血管新生过程中的作用

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【摘要】：动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是我国发病率和致死率最高的心脑血管疾病之一,动脉粥样硬化斑块稳定性丧失导致的斑块破裂以及继发的急性血栓形成是心血管疾病中的重大事件。稳定性斑块向易损斑块转化是动脉粥样硬化引起急性冠状动脉综合症的最主要原因。而斑块内血管新生可能是诱发易损斑块形成的重要刺激因素,易损斑块内新生的微血管结构缺乏完整性,通常只由一层内皮细胞构成,因而不完整的微血管增加了血管通透性,成为脂质、巨噬细胞和单核细胞浸润斑块的主要通道,破坏了斑块的稳定性进而导致急性心脑血管疾病的发生。近年,研究证明斑块破裂主要发生在斑块近心端的高切应力区域,血管内切应力的改变是AS易损斑块形成的重要刺激因素,也是血管新生的重要调节因素。但是对于切应力如何调控血管新生的机制还不清楚。基于此,本文拟探究切应力引起易损斑块血管新生的力学和分子学机制,明确细胞分化抑制因子1(Inhibitor of differentiation-1,Id1)和膜型基质金属蛋白酶(Membrane-type matrix metalloproteinases,MT-MMPs)是否参与剪切力调控血管新生,进而为深入了解AS易损斑块的发生机制提供新的理论依据,为动脉粥样硬化疾病治疗提供新的靶点。本文主要研究内容和结论如下:第一部分:在体研究切应力对动脉粥样硬化易损斑块血管新生的影响(1)对Apo E-/-小鼠颈动脉进行套环结扎,形成血管局部狭窄,通过小动物超声技术检测狭窄血管两端的血流速率和血管直径,结果显示近心端的切应力高于远心端;扫描电镜观察血管内层结构,发现狭窄血管近心端内皮层有损伤,而远心端区域血管内皮细胞层比较完整。(2)小鼠颈动脉狭窄模型构建成功,并用高脂饲料喂8周后,核磁共振扫描检测发现狭窄处血管形成了明显的斑块,HE染色发现狭窄近心端血管内斑块阻塞情况严重,斑块内形成大量新生微血管,而远心端低切应力区仅有一定程度的内膜增生;Masson染色和VG染色表明高切应区易损斑块内胶原含量和肌纤维含量显著性下降。第二部分:细胞水平研究切应力对血管新生相关因子Id1、MT1-MMP(Membrane-type matrix metalloproteinase-1)、MT4-MMP(Membrane-type matrix metalloproteinase-4)的影响分别用5dynes/cm2、12dynes/cm2、25dynes/cm2的力加载人脐静脉内皮细胞6h后,荧光定量PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测Id1,MTI-MMP,MT4-MMP的表达情况。结果发现高切应力25dynes/cm2会促进Id1,MTI-MMP,MT4-MMP的表达上调,而低切应力5dynes/cm2则会抑制其表达。第三部分:Id1调控MTI-MMP,MT4-MMP促进血管新生的机制研究(1)为了进一步的研究Id1与MTI-MMP,MT4-MMP的关系以及对血管新生的影响,慢病毒转染获得过表达Id1和干扰Id1的细胞株,RT-PCR和Western Blot检测发现过表达Id1会促进MT1-MMP、MT4-MMP的表达上调,干扰Id1的表达则相应的降低MT1-MMP、MT4-MMP的表达。(2)通过细胞划痕实验、基质胶侵袭实验和体外血管新生实验,发现过表达Id1能加速胞外基质的降解,增强细胞的迁移能力和大大提高内皮细胞血管新生能力,包括细胞形成管腔数量和管腔长度。上述研究进一步验证了Id1能调控MT1-MMP、MT4-MMP降解胞外基质来增强细胞迁移、侵袭能力,调控血管新生过程。
【关键词】：血管新生 分化抑制因子1(Id1) 切应力 MT1-MMP MT4-MMP
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 主要缩写词表10-11
• 1 绪论11-21
• 1.1 问题的提出11-12
• 1.2 AS的发病机理12-13
• 1.3 血流切应力与AS的关系13-15
• 1.4 斑块内血管新生与AS稳定性的关系15-16
• 1.4.1 AS易损斑块的特点15
• 1.4.2 斑块内血管新生与易损斑块15-16
• 1.5 Id1蛋白与易损斑块血管新生的关系16-17
• 1.5.1 Id1调控血管新生16-17
• 1.5.2 Id1调控AS易损斑块的形成和发展17
• 1.6 膜型基质金属蛋白酶在血管新生中的作用17-19
• 1.7 研究意义和研究内容19-21
• 1.7.1 研究意义19
• 1.7.2 研究内容19-21
• 2 高切应力介导血管新生促进易损斑块的形成21-33
• 2.1 引言21
• 2.2 材料21-22
• 2.2.1 实验仪器和耗材21-22
• 2.2.2 实验试剂22
• 2.2.3 实验动物22
• 2.3 方法22-25
• 2.3.1 构建ApoE-/-小鼠颈总动脉套环狭窄模型22-23
• 2.3.2 血管内超声成像技术检测血流量和血管直径23
• 2.3.3 血管内腔扫描电镜23
• 2.3.4 核磁共振检测23-24
• 2.3.5 斑块的形态学表征24-25
• 2.3.6 统计分析25
• 2.4 实验结果25-31
• 2.4.1 狭窄套环引起颈动脉血流动力学的改变25-26
• 2.4.2 高切应力破坏内皮层完整性26-27
• 2.4.3 核磁共振MRI分析斑块的形成27-28
• 2.4.4 高切应力促进斑块内血管新生28-30
• 2.4.5 高切应力促进胶原纤维、肌纤维的降解30-31
• 2.5 讨论31-33
• 3 切应力对Id1，MMP14，MMP17表达的影响33-46
• 3.1 引言33
• 3.2 实验材料33-35
• 3.2.1 实验仪器和耗材33-34
• 3.2.2 实验试剂34-35
• 3.3 实验方法35-41
• 3.3.1 HUVEC的培养、传代、冻存、复苏35
• 3.3.2 细胞力学加载35-36
• 3.3.3 细胞免疫荧光染色36
• 3.3.4 荧光定量PCR36-39
• 3.3.5 Western blot39-41
• 3.4 实验结果41-45
• 3.4.1 不同切应力处理HUVECs后细胞形态的变化41-42
• 3.4.2 细胞免疫荧光检测Id1、MMP14、MMP17的表达42-43
• 3.4.3 高切应力促进内皮细胞Id1、MMP14、MMP17基因的表达43-44
• 3.4.4 Western Blot检测Id1、MMP14、MMP17蛋白的表达44-45
• 3.5 讨论45-46
• 4 Id1通过调控MMP14，MMP17促进血管新生过程46-54
• 4.1 引言46
• 4.2 实验仪器和试剂46
• 4.3 实验方法46-48
• 4.3.1 HUVEC的慢病毒感染46-47
• 4.3.2 细胞迁移实验47
• 4.3.3 血管内皮细胞Matrigel基质胶上侵袭实验47
• 4.3.4 细胞管腔形成实验47-48
• 4.3.5 荧光定量PCR和western blot48
• 4.4 实验结果48-53
• 4.4.1 Id1过表达和Id1干扰内皮细胞的鉴定48-49
• 4.4.2 Id1调控MMP14，MMP17的表达49-50
• 4.4.3 过表达Id1促进细胞的迁移能力50-51
• 4.4.4 Id1促进细胞基质胶侵袭能力51-52
• 4.4.5 Id1促进体外血管新生52-53
• 4.5 讨论53-54
• 5 结论与展望54-56
• 5.1 主要结论54
• 5.2 后续工作展望54-56
• 致谢56-57
• 参考文献57-63
• 附录63
• A. 作者在攻读学位期间发表的论文和专利63
• B. 作者在功读硕士期间参与的课题63

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