匹伐他汀纳米颗粒改善内皮祖细胞生物学功能及修复损伤血管研究

发布时间：2017-09-12 12:02

  本文关键词：匹伐他汀纳米颗粒改善内皮祖细胞生物学功能及修复损伤血管研究

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【摘要】：研究背景与目的血管内皮损伤是动脉粥样硬化性疾病和介入治疗术后再狭窄的主要病理生理基础,因此,如何促进内皮的有效修复和再生是此类疾病良性转归的关键。近年来,内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)在损伤血管修复、缺血组织血管新生、正常内皮功能维持中的作用已引起广泛关注。但是在心血管疾病及其相关危险因素患者中,EPC数量减少且功能下降,修复损伤血管的能力下降,因此应用药物或其它干预因素增加EPC的数量并改善其功能是优化EPC治疗策略的重要手段。他汀类药物作为缺血性心血管疾病治疗的基石,具有独立于降脂以外的多重心血管保护作用,其中包括对内皮祖细胞生物学功能的改善,但这种作用多建立在较大剂量、长时间他汀类药物的应用上。作为新一代的他汀药物,匹伐他汀已被证实具有更强的调脂、改善内皮功能、逆转斑块等治疗价值,但是为达到这种获益所需局部药物浓度较高、服用时间较长,仍可引起全身不良反应。纳米技术的出现为药物在体内的转运提供了新的平台,以可生物降解的高分子材料做为药物载体,可改变其包裹药物的药代动力学特征,达到提高疗效、减轻不良反应等作用。近年来匹伐他汀纳米颗粒在促进缺血组织血管新生、逆转/稳定动脉粥样斑块及防治肺动脉高压中已显示出巨大优势。本实验旨在制备匹伐他汀纳米颗粒,观察匹伐他汀纳米颗粒对EPC生物学功能的影响,并对其增殖机制作初步探讨;在体研究内吞匹伐他汀纳米颗粒后EPC修复损伤血管功能。方法1.匹伐他汀纳米颗粒的制备及性质表征研究以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)为载体,匹伐他汀为包裹药物,采用超声乳化溶剂挥发法制备,电镜观察纳米颗粒形貌,纳米粒度仪测定其粒径及分布情况。高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)计算载药量和包封率,药物释放实验观察纳米颗粒的释药特点。2.大鼠脾源性EPC培养、鉴定密度梯度离心法获得大鼠脾脏单个核细胞,在添加胎牛血清、血管内皮生长因子的DMEM低糖培养基中培养,显微镜下观察细胞形态变化。Di I-ac LDL摄取与FITC-UEA-I结合实验鉴定EPC是否具有内皮细胞的特性,流式细胞术鉴定细胞表面内皮细胞特异性抗原和干细胞抗原。3.内皮祖细胞摄取纳米颗粒的研究以FITC为荧光探针,制备载FITC-PLGA纳米颗粒,与内皮祖细胞共孵育后,激光共聚焦显微镜下观察细胞摄取纳米颗粒情况。4.载体材料PLGA对EPC活性的影响取培养7天的EPC,予不同浓度空白PLGA纳米粒悬液(5、25、50、100、200μg/m L)处理,CCK8法检测空白PLGA纳米颗粒对EPC活性影响。5.观察匹伐他汀纳米颗粒对EPC生物学功能的影响取培养7天的EPC,予匹伐他汀纳米颗粒(含匹伐他汀浓度分别为0.001μM、0.01μM、0.1μM)培养24h后换新鲜培养基,同时设置空白对照组、空白纳米颗粒组、匹伐他汀原药组(0.001μM、0.01μM、0.1μM)。培养3天后,CCK8法、Transwell小室、人工计数、流式细胞术分别检测EPC增殖、迁移、粘附、凋亡功能。6.探讨PI3K/Akt信号通路在匹伐他汀纳米颗粒介导EPC增殖中的作用取培养7天的EPC,给予PI3K信号通路抑制剂LY294002预处理,观察其在匹伐他汀纳米颗粒介导EPC增殖中的作用,western blot检测匹伐他汀纳米颗粒对EPC Akt蛋白磷酸化的影响。7.匹伐他汀纳米颗粒干预后EPC修复损伤血管的研究建立大鼠颈动脉损伤模型,荧光标记各组EPC并经尾静脉注射。术后3天,荧光显微镜观察损伤血管EPC归巢情况,及其是否具备内皮细胞表型;术后7天,伊文氏兰染色评价损伤血管再内皮化;术后14天,HE染色后评估内膜增生情况。结果1.乳化法制备匹伐他汀纳米颗粒呈圆球形,外表光滑,平均粒径230.1±45nm(n=3)。载药量为(10.00±1.83)%(n=3),包封率为(35.54±5.40)%(n=3)。体外释放药物实验显示纳米颗粒具有缓释特性,2周累积释放量为(83.20±5.63)%(n=3)。2.脾源性EPC培养和鉴定培养7天的贴壁细胞,予Di I-ac LDL和FITC-UEA-I染色。激光共聚焦显微镜下观察,Di I-ac LDL阳性染色呈红色,FITC-UEA-I阳性染色呈绿色,双染阳性呈黄色,为正在分化的EPC,双染阳性率为87.25±2.03%(n=3);流式细胞术鉴定细胞表达内皮细胞特异性抗原VEGFR-2阳性率79.00±5.21%,干细胞抗原CD34阳性率为80.07±4.70%(n=3)。3.内皮祖细胞对纳米颗粒的摄取FITC纳米颗粒悬液与EPC共培养,激光共聚焦显微镜显示:FITC纳米颗粒大都分布于细胞质中,呈颗粒状绿色荧光。4.载体材料PLGA对EPC活性的影响随着空白PLGA纳米颗粒浓度的增加,细胞的OD值较对照组均无明显变化(P=0.495),提示PLGA材料与内皮祖细胞生物相容性良好。5.匹伐他汀纳米颗粒对EPC生物学功能的影响5.1对增殖功能影响:CCK8法分析显示匹伐他汀纳米颗粒可促进EPC增殖(0.001μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组,1.52±0.04 vs 1.41±0.02,P(27)0.05;0.01μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组1.64±0.06 vs 1.41±0.02,P(27)0.01;0.1μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组,1.86±0.05 vs 1.41±0.02,P(27)0.01)。与匹伐他汀原药相比,在0.01μM、0.lμM浓度水平,匹伐他汀纳米颗粒组促增殖作用显著(0.01μM匹伐他汀纳米颗粒vs0.01μM匹伐他汀,1.64±0.06 vs 1.53±0.06,P(27)0.05;0.lμM匹伐他汀纳米颗粒vs 0.1μM匹伐他汀,1.86±0.05 vs 1.73±0.06,P(27)0.01)(n=9)。5.2对迁移功能影响:随着匹伐他汀纳米颗粒浓度升高,EPC迁移细胞数增加(0.01μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组,89.28±4.25 vs 77.44±7.42,P(27)0.05;0.1μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组,108.22±5.85 vs 77.44±7.42,P(27)0.01)。在0.lμM浓度水平,匹伐他汀纳米颗粒组EPC迁移数高于同浓度匹伐他汀原药组(0.lμM匹伐他汀纳米颗粒vs 0.1μM匹伐他汀,108.22±5.85 vs 94.00±5.86,P(27)0.01)(n=18)。5.3对黏附功能影响:随着匹伐他汀纳米颗粒浓度升高,EPC贴壁细胞数增加(0.001μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组,37.00±3.06 vs 30.72±4.17,P(27)0.05;0.01μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组,43.06±2.01 vs 30.72±4.17,P(27)0.01;0.1μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组,50.28±3.08 vs 30.72±4.17,P(27)0.01)。在0.01μM、0.lμM浓度水平,匹伐他汀纳米颗粒组EPC贴壁细胞数均高于同浓度匹伐他汀原药组(0.01μM匹伐他汀纳米颗粒vs 0.01μM匹伐他汀,43.06±2.01 vs 38.28±4.03,P(27)0.05;0.lμM匹伐他汀纳米颗粒vs 0.1μM匹伐他汀,50.28±3.08 vs 44.33±0.93,P(27)0.05)(n=18)。5.4对凋亡功能影响:流式细胞分析提示匹伐他汀纳米颗粒可抑制EPC凋亡(0.001μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组,14.07±2.69%vs 20.31±2.09%,P(27)0.01;0.01μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组,10.37±2.04%vs 20.31±2.09%,P(27)0.01;0.1μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组,3.28±1.34%vs 20.31±2.09%,P(27)0.01)。在0.lμM浓度水平,匹伐他汀纳米颗粒抑制EPC凋亡作用优于匹伐他汀原药组(0.lμM匹伐他汀纳米颗粒vs 0.1μM匹伐他汀,3.28±1.34%vs 8.54±2.64%,P(27)0.01)(n=3)。6.PI3K/Akt信号通路在匹伐他汀纳米颗粒介导EPC增殖中的作用CCK8分析显示匹伐他汀纳米颗粒可促进EPC增殖(0.lμM匹伐他汀纳米颗粒vs空白纳米对照组,1.99±0.10 vs 1.43±0.06,P(27)0.01)(n=9),同时Western blot结果提示匹伐他汀纳米颗粒显著促进EPC Akt(Ser473)蛋白磷酸化(0.1μM匹伐他汀纳米颗粒vs对照组,0.85±0.13 vs 0.55±0.14,P(27)0.01;0.1μM匹伐他汀纳米颗粒vs 0.1μM匹伐他汀原药,0.85±0.13 vs 0.70±0.17,P(27)0.05)(n=4)。而给予PI3K抑制剂处理后,匹伐他汀纳米颗粒促增殖作用受到显著抑制(0.lμM匹伐他汀纳米颗粒vs 0.1μM匹伐他汀纳米颗粒+LY294002(10μM),1.99±0.10 vs 1.57±0.09,P(27)0.01)(n=9),同时Akt(Ser473)蛋白磷酸化水平减弱(0.1μM匹伐他汀纳米颗粒vs 0.1μM匹伐他汀纳米颗粒+LY294002(10μM),0.85±0.13 vs 0.66±0.15,P(27)0.01)(n=4)。7.匹伐他汀纳米颗粒干预后EPC修复损伤血管的研究7.1对EPC归巢的影响:EPC移植后3天,荧光显微镜下观察:损伤部位可见预先标记的EPC聚集,同时FITC-UEA-I荧光染色阳性。且匹伐他汀纳米颗粒处理后归巢EPC数多于匹伐他汀原药组(匹伐他汀纳米颗粒干预EPC移植组vs匹伐他汀原药干预EPC移植组,16.67±4.47 vs 12.33±1.53,p0.05)(n=3)。7.2对损伤血管再内皮化的影响:伊文氏兰染色法评价再内皮化,结果显示:EPC移植可促进损伤血管再内皮化,且以匹伐他汀纳米颗粒组效果显著(匹伐他汀纳米颗粒干预EPC移植组vs匹伐他汀原药干预EPC移植组,0.48±0.05 vs 0.41±0.02,p0.05)(n=3)。7.3对损伤血管内膜增生的影响:HE染色后软件分析内膜与中膜面积比,结果显示:EPC移植可抑制内膜增生,且以匹伐他汀纳米颗粒组效果显著(匹伐他汀纳米颗粒干预EPC移植组vs匹伐他汀原药干预EPC移植组,0.79±0.23 vs 1.02±0.14,p0.05)(n=6)。结论1.超声乳化溶剂挥发法可制备匹伐他汀纳米颗粒,具备合适的粒径大小和粒径分布,模拟生理条件下具有缓释效能;2.乳化法制备的纳米颗粒可被大鼠脾源性EPC吞噬摄取,且载体材料PLGA与EPC生物相容性良好;3.匹伐他汀纳米颗粒可促进EPC增殖、迁移、黏附,并抑制其凋亡,效果较匹伐他汀原药显著;4.PI3K/Akt信号通路参与匹伐他汀纳米颗粒介导的EPC增殖;5.匹伐他汀纳米颗粒可有效促进移植EPC归巢、损伤血管再内皮化、抑制内膜增生。
【关键词】：匹伐他汀 纳米颗粒 内皮祖细胞 PI3K/Akt信号通路 再内皮化 内膜增生
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 英文缩写一览表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-15
• 前言15-17
• 第一部分 匹伐他汀纳米颗粒的制备及其性质表征研究17-24
• 1.1 实验材料17-18
• 1.2 实验方法18-19
• 1.3 实验结果19-21
• 1.4 讨论21-23
• 1.5 小结23-24
• 第二部分 匹伐他汀纳米颗粒对内皮祖细胞生物学功能影响及相关机制研究24-40
• 2.1 实验材料25-26
• 2.2 实验方法26-30
• 2.3 结果30-37
• 2.4 讨论37-39
• 2.5 小结39-40
• 第三部分 匹伐他汀纳米颗粒修复损伤血管研究40-50
• 3.1 实验材料40-41
• 3.2 实验方法41-43
• 3.3 结果43-48
• 3.4 讨论48-49
• 3.5 小结49-50
• 全文结论50-51
• 参考文献51-57
• 文献综述 基于纳米技术的干细胞疗法在心血管疾病中的应用进展57-63
• 参考文献60-63
• 研究生期间发表论文63-64
• 致谢64

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本文编号：837087