先天性进行性皮质点状白内障相关候选基因定位及功能研究

发布时间：2017-10-17 20:01

  本文关键词：先天性进行性皮质点状白内障相关候选基因定位及功能研究

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【摘要】：研究背景 白内障是目前我国乃至世界首位的致盲原因。其中,先天性白内障已成为儿童失明和视力障碍的主要原因,国外报道其发病率为(1-6)／万,居儿童失明原因的第二位。先天性白内障的发病原因众多,机制复杂,目前认为约1/3与遗传因素有关。因此,疾病相关候选基因和突变方式的研究成为遗传性白内障的研究热点。迄今为止,已经鉴定和克隆的与遗传性白内障有关的致病基因至少有26个,相关的突变型更是多达40余种。然而,遗传性白内障具有明显的遗传异质性(即同基因型可具有不同的临床表型,而同一临床表现也可由不同的基因型决定),其形态不一的临床表型无疑为致病基因的鉴定增加了困难。同时,随着人类基因组计划的完成,各项研究特别是遗传性疾病的研究将逐渐迎来“后基因组时代”,即对致病基因的功能以及突变蛋白具体致病机制的研究。因此,遗传性白内障致病基因的鉴定和功能研究,不仅将进一步丰富目前已知的疾病相关基因库,为开展遗传性白内障的产前诊断和基因诊断作出贡献,而且有助于揭示晶状体混浊的发病机制,为理解白内障的致病机制和后续相关的基因治疗奠定基础。本文就我们收集的我国浙江省地区一个先天性进行性皮质点状白内障家系进行致病基因定位和突变蛋白功能研究。 研究方法 对参与本次研究的家系成员进行详细的家族史及临床资料的采集,并对所有的家系成员进行全面的眼科检查,包括视力、裂隙灯、散瞳眼底检查等。根据系谱行遗传方式分析,初步确定家系的遗传方式。提取家系成员外周血样本并抽提基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增疾病相关的候选基因的所有外显子及内含子外显子交界区,利用直接测序法确定致病的突变基因及位点,借助生物信息学方法(Polyphen-2and SIFT)对突变基因的结构和功能进行分析。以正常人晶状体cDNA文库为模板,通过PCR反应获得野生型目的基因的cDNA序列,利用DNA重组技术克隆至真核表达载体pcDNA3.1-,利用定点突变技术构建携带突变基因的质粒,分别转染至人宫颈癌上皮细胞(HeLa),免疫荧光技术检测HeLa细胞中AQP0的表达并采用激光共聚焦显微镜观察蛋白定位。 结果 1、临床检查表明此遗传性白内障家系的表型为皮质点状混浊,呈进行性,遗传方式为常染色体显性遗传。针对家系候选基因进行突变筛查,对CRYAA. CRYBA1、CRYGD、CRYGS、MIP、GJA3六个候选基因进行测序,发现在MIP基因第2号外显子第88个碱基发生了G→C的置换(c.448GC),该突变使得MIP编码的AQP0蛋白的第150个氨基酸(位于Loop D区段)发生天冬氨酸到组氨酸的转变(p.D150H),家系中参与研究的正常人及200名正常对照组成员均未检测到此突变存在,PolyPhen-2和SIFT分数均提示D150H为影响蛋白质结构和功能的有意义的突变。 2、分别成功构建表达野生型AQP0蛋白的质粒pcDNA3.1--wtAQP0及表达突变蛋白的pcDNA3.1--AQPOD150H,转染HeLa细胞后,免疫荧光观察发现突变蛋白在细胞内聚集较多,细胞膜上定位较野生组明显减少,提示此突变影响了AQP0蛋白正常的胞膜转运机制。 结论 1、本文收集到常染色体显性遗传性白内障家系1个,研究首次报道了1个与先天性进行性皮质点状白内障有关的MIP基因新突变：c.448GC (p.D150H); 2、此突变影响了AQP0蛋白正常的胞膜转运机制,导致细胞膜上AQP0蛋白定位明显减少； 3、本研究拓展了遗传性白内障的基因突变型,揭示了AQP0蛋白突变引起遗传性白内障的致病机制。
【关键词】：先天性白内障 常染色体显性遗传 MIP 基因突变 蛋白定位
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R776.1
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 英文缩略语11-12
• 目次12-14
• 第一部分 先天性进行性皮质点状白内障家系相关候选基因筛选14-27
• 1 引言14-16
• 2 材料及方法16-21
• 3 实验结果21-25
• 4 讨论25-26
• 5 小结26-27
• 第二部分 野生型和突变型基因表达载体的构建27-36
• 1 引言27-28
• 2 材料与方法28-32
• 3 实验结果32-34
• 4 讨论34-35
• 5 小结35-36
• 第三部分 突变基因功能研究36-47
• 1 引言36-38
• 2 材料与方法38-41
• 3 实验结果41-44
• 4 讨论44-46
• 5 小结46-47
• 参考文献47-52
• 综述52-64
• 参考文献59-64
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果64-65

【共引文献】

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本文编号：1050752