人泪腺腺样囊性癌细胞系异种种植研究及其肿瘤干细胞的分离培养和鉴定

发布时间：2017-10-24 02:36

  本文关键词：人泪腺腺样囊性癌细胞系异种种植研究及其肿瘤干细胞的分离培养和鉴定

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【摘要】：目的 1.探讨人泪腺腺样囊性癌细胞系的生物学特性。 2.建立人泪腺腺样囊性癌的动物模型,为研究泪腺腺样囊性癌的发生发展以及治疗提供实验依据和条件。 3.从人泪腺腺样囊性癌细胞系LACC中分离培养泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞,并对其特性进行鉴定。 方法 1.实验第一部分：将人泪腺腺样囊性癌(lacrimal adenoid cystic carcinoma,LACC)细胞系接种于10只裸鼠腋下的皮下,注射细胞悬液后每天观察裸鼠并测量裸鼠荷瘤的最长径L和最短径W,并用公式V(荷瘤体积)=(L×W2)/2计算出荷瘤的体积。分别于注射细胞悬液后14天、28天、35天、42天、49天随机取2只裸鼠的荷瘤以及裸鼠的肝脏、肺和腋下淋巴结。对注射细胞后14天的荷瘤行透射电镜观察,对注射细胞后14天、28天、35天、42天、49天的荷瘤行HE染色、免疫组织化学染色检测Keratin、Vimentin、α-SMA、S-100、Desmin的表达以及提取其总RNA,用RT-PCR检测该荷瘤的人类β-actin的表达情况。对所取的裸鼠肝脏、肺和腋下淋巴结组织切片,行HE染色,观察有无肿瘤转移。 2.实验第二部分：将LACC细胞消化、离心制成单细胞悬液,悬浮于无血清培养基(serum free medium,SFM)中获得肿瘤细胞微球体；应用有限稀释和单克隆形成实验确定该细胞系中肿瘤干细胞的比例；MTT检测肿瘤微球体的增殖能力以及其耐药性；流式细胞仪检测细胞表面分子标志CD44+/CD24-在两种细胞中的表达情况；向SFM中滴加含有血清培养基(serum supplied medium,SSM)诱导LACC肿瘤微球体分化,并观察其形态学变化。 结果 1.接种细胞系后7天10只裸鼠腋下皮下全部长出荷瘤,成瘤率为100%。注射细胞悬液后14天取出的荷瘤呈圆形或椭圆形,表面可见包膜；不与周围组织粘连；荷瘤质地中等,剖面呈苍白色。注射细胞悬液后49天的荷瘤表面仍可见包膜,荷瘤侵入裸鼠胸壁,甚至侵入胸腔生长,但不与胸腔脏器粘连。 2.荷瘤的组织形态学及生物学行为观察：1)HE染色观察见荷瘤具有典型的上皮性肿瘤组织结构。荷瘤以实体形为主,局部见粘液变、筛网样结构；细胞为圆形或椭圆形,细胞边界不太清楚,有丰富的粉染的胞浆,细胞核深染、大小差异明显,可见瘤巨细胞,病理性核分裂常见。2)透射电子显微镜下观察示荷瘤瘤细胞大小不等。相邻细胞间以缝隙连接为主,偶见发育不良的桥粒,细胞表面有微绒毛,未见明确腺管形成。胞浆内粗面内质网轻度扩张,散在线粒体,可见多聚核糖核蛋白体。有些肿瘤细胞胞浆中可见束状微丝。核浆比例倒置,核形态不规则,核膜凹陷,可见多核仁,核周间隙扩大。未见到典型核分裂相。 3)免疫组织化学染色示荷瘤对Keratin、Vimentin、α-SMA、S-100阳性表达,Desmin阴性表达。4)RT-PCR检测荷瘤表达人类β-actin基因。5)光镜下观察,未发现肿瘤转移至裸鼠肝脏、肺和腋下淋巴结。 3. LACC细胞系中有(0.92±0.015)%的肿瘤细胞在无血清培养基中能够存活增殖形成自由漂浮的细胞微球体；微球体形状规则,立体感强,球体内细胞排列紧密,富有折光性,并可稳定传代。与贴壁细胞相比,LACC肿瘤微球体具有更强的体外增殖能力、对顺铂具有更强的耐药性。流式细胞仪表面标志检测,LACC细胞CD44+/CD24比率为23.77%,而LACC肿瘤微球体CD44+/CD24比率为84.25%。在含血清环境下LACC肿瘤细胞微球体可分化为贴壁生长的单层细胞,与SSM中培养的LACC细胞无明显差异。 结论1.人泪腺腺样囊性癌细胞系(LACC)具有一般恶性肿瘤的特点,同时也具有腺样囊性癌细胞的特点。荷瘤具有与原瘤一致的组织学特性,该动物模型易复制,时间短,成功率高,是研究泪腺腺样囊性癌的良好模型,为研究该肿瘤的发生发展以及治疗途径提供了一个极为有用的工具。 2.用含有生长因子的SFM悬浮人泪腺腺样囊性癌细胞系LACC可获得泪腺腺样囊性癌肿瘤细胞微球体,此肿瘤微球体中富集有肿瘤干细胞,这为人泪腺腺样囊性癌肿瘤干细胞的研究提供了一个理想的模型系统。
【关键词】：泪腺腺样囊性癌 肿瘤细胞系 裸鼠 动物模型 肿瘤干细胞 无血清培养基
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 目录8-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-16
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、人泪腺腺样囊性癌细胞系异种种植研究16-35
• 1.1 对象和方法16-26
• 1.1.1 实验动物16
• 1.1.2 细胞系16
• 1.1.3 主要仪器16-17
• 1.1.4 主要试剂、耗材17-19
• 1.1.5 细胞培养19-20
• 1.1.6 制备一定密度的细胞悬液20-21
• 1.1.7 异种种植实验21
• 1.1.8 HE染色21
• 1.1.9 透射电镜观察荷瘤21
• 1.1.10 免疫化学染色21-23
• 1.1.11 LACC荷瘤、细胞系以及裸鼠肝脏中人类β-actin和小鼠β-actin基因表达检测23-26
• 1.2 结果26-32
• 1.2.1 皮下荷瘤生长情况26-28
• 1.2.2 荷瘤的组织学观察28
• 1.2.3 肿瘤转移情况28
• 1.2.4 透射电镜观察荷瘤28-30
• 1.2.5 免疫化学染色观察30-31
• 1.2.6 人类β-actin和小鼠β-actin基因表达31-32
• 1.3 讨论32-34
• 1.3.1 LACC细胞系裸鼠异种种植33-34
• 1.3.2 LACC荷瘤的组织生物学特性34
• 1.4 小结34-35
• 二、人泪腺腺样囊性癌细胞系肿瘤干细胞分离培养和鉴定35-49
• 2.1 对象和方法35-40
• 2.1.1 细胞系35
• 2.1.2 主要仪器35
• 2.1.3 主要试剂、耗材35-37
• 2.1.4 LACC中肿瘤微球体的分离培养和传代37-38
• 2.1.5 有限稀释、单克隆形成实验38
• 2.1.6 MTT法检测LACC肿瘤微球体体外增殖能力38-39
• 2.1.7 药物敏感实验39
• 2.1.8 流式细胞仪检测CD44~+/CD24~-的表达39-40
• 2.1.9 LACC肿瘤微球体分化能力40
• 2.1.10 统计学方法40
• 2.2 结果40-46
• 2.2.1 显微镜下观察LACC肿瘤微球体的形成40-42
• 2.2.2 有限稀释、单克隆形成实验42-43
• 2.2.3 细胞增殖实验43-44
• 2.2.4 两种细胞对顺铂的敏感性44
• 2.2.5 CD44~+/CD24~-在两种细胞中的表达44-46
• 2.2.6 LACC肿瘤微球体分化能力46
• 2.3 讨论46-48
• 2.3.1 LACC肿瘤干细胞分离培养46-47
• 2.3.2 LACC肿瘤干细胞的鉴定47-48
• 2.4 小结48-49
• 结论49-50
• 参考文献50-54
• 发表论文和参加科研情况说明54-55
• 综述 腺样囊性癌肿瘤干细胞标志物的研究进展55-64
• 综述参考文献61-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 周蓓清;何彦津;林婷婷;朱利民;;人泪腺腺样囊性癌细胞的原代培养及其形态学特征[J];中华眼科杂志;2013年10期

2 Weiqiang Tang;Yan Hei;Lihua Xiao;;Recurrent orbital space-occupying lesions:a clinicopathologic study of 253 cases[J];Chinese Journal of Cancer Research;2013年04期

3 Li-Xiao Zhou;Yu Zhu;;Influence of Ginkgo biloba extract on the proliferation,apoptosis of ACC-2 cell and Survivin gene expression in adenoid cystic carcinoma of lacrimal gland[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2012年11期

4 林婷婷;朱利民;何彦津;张虹;;肿瘤干细胞相关标志蛋白在眼眶腺样囊性癌中的表达分析[J];中华眼科杂志;2011年08期

5 陈垂史;黄志权;王友元;张大明;赵小朋;王慧菁;李海刚;;骨桥蛋白、CD44v6在涎腺腺样囊性癌转移中的意义[J];分子诊断与治疗杂志;2010年03期

6 林婷婷;何彦津;朱利民;罗浩;常津;张虹;张红梅;;叶酸靶向长春新碱纳米微球对腺样囊性癌细胞活性的影响[J];眼科新进展;2010年04期

7 陈芳;邓晓光;宋琦;;涎腺腺样囊性癌单细胞增殖的实验研究[J];遵义医学院学报;2009年06期

8 宋琦;陈芳;李萍;文国容;;CD44、CD24、MMP9在涎腺腺样囊性癌的表达及意义[J];贵州医药;2009年09期

9 陈伟军;王成;曾亮;;COX-2、CD44在腺样囊性癌中的表达及意义[J];中国现代医生;2009年16期

10 陈芳;宋琦;李萍;文国容;;ABCG2在腺样囊性癌的表达及意义[J];贵州医药;2008年06期

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本文编号：1086653