CFB-siRNA抑制实验性大鼠脉络膜新生血管的实验研究

发布时间：2017-10-31 00:23

  本文关键词：CFB-siRNA抑制实验性大鼠脉络膜新生血管的实验研究

  更多相关文章： B因子 补体旁路途径 小干扰RNA MMP-13 脉络膜新生血管

【摘要】：目的：年龄相关性黄斑变性(age-related macular degenerate-on,AMD)是导致55岁以后视力不可逆损害的主要原因之一，其分为干性AMD和湿性AMD。湿性AMD的主要特征是脉络膜新生血管(choroidalneovascularization,CNV)，CNV可导致中心视力的突然减退。目前对于CNV的发生机制尚未十分明确，已上市用于CNV治疗的药物主要是针对已形成的CNV，其作用时效短且不能根治CNV。CNV的高发生率、发生机制的不明确性、以及难以根治成为医学的重大挑战。研究表明炎症反应在CNV中起到重要作用，补体旁路途经的激活所产生的膜攻击复合物(menbrane attack comples,MAC)在实验性CNV的发生中起到决定性作用。补体旁路途径中有一关键因子为B因子，前期实验证明通过RNA干扰技术抑制旁路途径中B因子的表达，可以有效地抑制大鼠CNV的发生。基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinase,MMPS)可以降解细胞外基质，有利于CNV穿过Bruch膜，研究发现发生CNV时血管内皮细胞和巨噬细胞分泌MMPs。已有数种MMPs已被证明存在于AMD患者的CNV中。MMP-13与软组织退化性关节炎及多种癌症的发生有关，具有极强的降解细胞外基质能力，其与激光诱导的大鼠CNV是否有关还不得而知。前期实验中已成功构建CFB-siRNA，并通过体外及体内研究证明了CFB-siRNA抑制CNV及其相关生长因子如VEGF、PDGE等的确切性。前期实验中未对CFB-siRNA抑制MAC的沉积做成评价，本实验将进一步完善CFB-siRNA抑制实验性CNV的实验研究，并进一步探讨MMP-13与激光诱导的CNV之间的关系以及MAC的沉积是否能诱导MMP-13的分泌。 方法： 1CFB-siRNA在体内转染靶向性的实验研究。 1.18-10周健康棕色挪威(Brown Norway，BN)大鼠24只，随机分为2组，每组12只。氪激光(波长647nm,光斑直径200μm,功率260mW,曝光时间0.05s)围绕视盘均匀光凝9个点，以见到有气泡产生提示Bruch膜被击穿为准建立大鼠CNV模型。 1.2随机分为实验组、实验对照组。实验组与实验对照组均予激光建立动物模型，实验组通过尾静脉注射75μgB因子siRNA，实验对照组通过尾静脉注射生理盐水。注射方式：尾静脉快速注射法；注药时间：光凝后第2天、4天、6天。观察时间为激光后3、5、7、14d。于14d时行荧光素眼底血管造影(FFA)。 1.3处死大鼠，摘除眼球取眼后段组织制作石蜡切片。选取激光斑点及其附近处组织做切片，免疫组织化学观察C5b-9(MAC)的表达情况。 1.4图像分析与统计学处理。 采用SPSS16.0软件对所得数据进行分析，观察CFB-siRNA抑制C5b-9(MAC)表达的情况。 2MMP-13表达与CNV形成关系的实验研究。 2.18-10周健康棕色挪威(Brown Norway，BN)大鼠30只，分为实验组、空白组。氪激光(波长647nm,光斑直径200μm,功率260mW,曝光时间0.05s)围绕视盘均匀光凝9-10个点，以见到有气泡产生提示Bruch膜被击穿为准建立大鼠CNV模型。 2.2实验组予激光建立CNV模型。观察时间为激光后3、5、7、14d。实验组与空白组观察指标为RT-PCR及免疫组织化学观察MMP-13的表达情况。 2.3图像分析与统计学处理。 采用SPSS16.0软件对所得数据进行统计学分析。 3CNV形成过程中MAC的沉积能否诱导MMP-13表达的实验研究。 3.18-10周健康棕色挪威(Brown Norway，BN)大鼠24只分为实验组与实验对照组，均予激光建立CNV动物模型。实验组予尾静脉注射75μgB因子siRNA，实验对照组通过尾静脉注射生理盐水。注药时间：光凝后第2天、4天、6天。观察时间为激光后3、5、7、14d。 3.2观察指标为RT-PCR及免疫组织化学观察MMP-13的变化(免疫组织化学材料来自实验第一部分与第二部分)。 3.3采用SPSS16.0软件对所得数据进行统计学分析。 结果： 1CFB-siRNA在体内转染靶向性的实验研究。 1.1FFA表现为造影早期强荧光斑，晚期出现与视网膜血管无关的荧光素渗漏。 1.2实验组比实验对照组CNV发生率明显降低。 1.3免疫组织化学结果显示：实验对照组C5b-9(MAC)在第3天时即有沉积，到第5天时达高峰，以后逐渐减低。实验组C5b-9(MAC)一直处于低表达状态。两组各时间点相比较MAC的沉积于光凝后第3、5、7天差异具有统计学意义。 2MMP-13表达与CNV形成关系的实验研究。 2.1免疫组织化学染色显示MMP-13表达位于细胞浆与细胞核。在实验组中MMP-13于光凝后第5天开始明显增多，7天时达顶峰，，以后至14天时表达处于稳定。在空白组中一直处于低表达。两组各时间点相比较于光凝后第5、7、14天表达存在显著差异。 2.2RT-PCR结果显示MMP-13在空白组处于低表达，在实验组中MMP-13于光凝后第3天时表达即开始增加，5天时持续增加，7天达顶峰，以后趋于平稳。两组各时间点相比较于光凝后第3天开始差异即有统计学意义。 3CNV形成过程中MAC的沉积能否诱导MMP-13表达的实验研究。 3.1免疫组织化学及RT-PCR结果均显示实验组与实验对照组MMP-13表达情况基本一致。 结论： 1尾静脉注射高剂量CFB-SiRNA能够有效抑制激光诱导大鼠CNV的生成，CFB-SiRNA能靶向性抑制实验性CNV中C5b-9(MAC)的表达，同时也证明导致激光诱导的CNV中MAC沉积的途径是补体旁路途径。 2MMP-13与激光诱导的大鼠CNV的形成有一定相关性。 3抑制MAC的沉积不能抑制MMP-13的分泌，说明在激光诱导的大鼠CNV形成过程中，补体旁路途径与MMP-13处于两条不同的途径。
【关键词】：B因子 补体旁路途径 小干扰RNA MMP-13 脉络膜新生血管
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R773.4
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 引言12-14
• 第一部分 CFB-siRNA 在体内转染靶向性的实验研究14-25
• 前言14
• 材料与方法14-17
• 结果17-18
• 附图18-20
• 附表20-21
• 讨论21-22
• 小结22-23
• 参考文献23-25
• 第二部分 MMP-13 的表达与 CNV 形成关系的观察25-36
• 前言25
• 材料与方法25-28
• 结果28-29
• 附图29-31
• 附表31-32
• 讨论32-33
• 小结33-34
• 参考文献34-36
• 第三部分 CNV 形成过程中 MAC 的沉积能否诱导 MMP-13 表达的实验研究36-46
• 前言36
• 材料与方法36-38
• 结果38-39
• 附图39-41
• 附表41-42
• 讨论42-43
• 小结43-44
• 参考文献44-46
• 结论46-47
• 综述 炎症反应及血管因子在脉络膜新生血管中的作用及其治疗47-61
• 参考文献53-61
• 致谢61-62
• 个人简历62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 黄丹,吴波;基质金属蛋白酶抑制剂治疗癌症的临床前景[J];国外医学.药学分册;2001年02期

2 郭会灿;;RNA干扰技术的基础研究与应用[J];生物技术通报;2011年04期

3 曾军,姜德咏,刘湘平,朱晓华,唐罗生;MMP-2和MMP-9在脉络膜新生血管膜的表达[J];眼科新进展;2004年06期

4 许琴;肖煜晨;;补体和膜攻击复合物在脉络膜新生血管形成中的作用[J];眼科新进展;2011年03期

本文编号：1120002