磷酸化15位点丝氨酸对Hsf4b转录活性的调控作用

发布时间：2017-10-31 19:43

  本文关键词：磷酸化15位点丝氨酸对Hsf4b转录活性的调控作用

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【摘要】：背景： 先天性白内障是导致儿童失明的主要原因，大约0.3-1.5/1000的儿童患有先天性白内障，其主要病理改变为晶状体发育迟缓、晶状体内非透明瘢块组织形成。染色体异常为先天性白内障的主要致病原因[1]，大量研究证据表明，转录因子基因突变和功能缺陷是诱发先天性白内障的遗传病因之一，如Pax6、FoxE3、Six3、Prox1、Sox2/3、Maf、Pitx3、AP-2a和Hsf4[2-4]。在正常情况下，这些转录因子的瞬时激活和灭活决定晶状体不同发育阶段，如Pax6在胚胎早期neuronal ectodem的表面细胞内被激活，促使外胚层上皮细胞形成晶状体placode和晶状体vesicle结构、诱导上皮细胞向初级纤维细胞分化、调控δ-crystallin和alpha A-crystallin等多种蛋白的表达[5,6]。出生后随着晶状体的成熟，Pax6转录活性被抑制。Pax6基因突变与临床先天遗传性白内障的发生密切相关[7]。热休克转录因子4(Hsf4)是调控新生儿期晶状体发育的关键转录因子。正常情况下，Hsf4蛋白在胚胎E13.5晶状体组织内开始表达，在新生儿期（P1-P28）达到高峰，随着晶状体成熟而逐渐减少[8-10]。Hsf4DNA结合域密码错义突变(如L115P、I87V、A20D和H74R)与中国和丹麦家族常染色体显性遗传性lamellar型白内障[4]，以及中国家族性显性遗传性总白内障(total white cataract)的发生密切相关[11]。敲除小鼠Hsf4基因可诱发新生期小鼠先天性白内障，主要病理改变为晶状体前囊上皮非正常增生、纤维细胞内变性蛋白堆积和纤维细胞终末分化障碍[8-10]。因此认为Hsf4转录活性对维持新生儿期晶状体正常发育至关重要。 Hsf4是热休克转录因子家族成员之一，在机体内有两种亚型Hsf4a和Hsf4b.它们来源于同一个基因的不同mRNA剪辑过程。 Hsf4a和Hsf4b因结构不同造成其转录活性相反。Hsf4a为转录抑制子，而Hsf4b则为转录激活子。晶状体中只有Hsf4b这一种活性形式。它主要参与调控小分子热休克蛋白（Hsp25, r-crstallin, a-crystallin和纤维细胞骨架蛋白（imentin，filesin)等蛋白的表达。其转录活性受磷酸化调控。但是磷酸化调控Hsf4转录活性的机理和相关信号通路不清楚。探讨Hsf4b磷酸化调控机理对揭示Hsf4转录功能障碍而诱发先天白内障的机理具有重要意义。我们应用丙氨酸定点突变技术，将Hsf4b分子中的高危磷酸化位点做突变扫描，结果发现Hsf4b DNA结合域的15位点丝氨酸突变对Hsf4b转录活性有明显的抑制作用。本课题通过构建Hsf4b DNA结合域15位点突变表达载体，构建其在小鼠晶状体上皮细胞中稳定表达的细胞株，并通过一系列实验，集中探讨了S15位点磷酸化对Hsf4b转录活性的调控机理。 目的： 通过突变S15A位点研究磷酸化S15位点对Hsf4b转录活性的调控机理。 方法： 1.根据Genebank中小鼠的Hsf4b基因序列，按照设计引物的要求，使用primer premier5引物设计软件及GPS2.1磷酸化位点检测软件，设计S15位点突变引物：（Primer S15上游引物： GAG CCA GGC CCC GCC CCC GTG CCT GCCPrimer S15下游引物：GGC AGG CAC GGG GGC GGG GCC TGG CTC）通过基因扩增技术突变Hsf4b DNA结合域15位点，构建突变体载体---pWZL-HA-Hsf4b-S15A，酶切及测序鉴定突变位点。 2.将表达野生Hsf4b和突变Hsf4b/S15A的逆转录病毒感染小鼠晶状体上皮细胞（mLEC/Hsf4-/-），用blasticidin筛选成功构建稳定株。 3.通过western-blotting验证该位点的突变影响了其下游蛋白的表达。 4.设计luciferase荧光素酶实验检测Hsf4b和Hsf4b/S15A突变体对α B-晶体蛋白（alpha B-crystallin）基因启动子的调控。 结果： 1.通过基因扩增技术将Hsf4b DNA结合域15位点突变，，构建pWZL-HA-Hsf4b-S15A突变体载体。构建其在小鼠晶状体上皮细胞（mLEC）中稳定表达的细胞株。 2．与野生Hsf4b相比，Hsf4b-S15A突变可明显抑制下游蛋白HSP25、alpha B-crystallin、alpha A-crystallin的表达。 3．15位点突变后的Hsf4b能抑制alpha B-crystallin基因启动子的转录。 结论： Hsf4bS15位点的磷酸化对Hsf4b转录活性调控至关重要。丙氨酸突变S15A可明显抑制Hsf4b对下游蛋白HSP25、alpha B-crystallin和alphaA-crystallin的转录调控。磷酸化S15位点参与调控Hsf4b与下游基因启动子的相互作用。
【关键词】：Hsf4b 白内障 晶状体 磷酸化调控 丙氨酸定点突变
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R776.1;Q75
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 英文缩略词表(ABBREVIATION)11-13
• 1 引言13-15
• 2 实验试剂与仪器15-23
• 2.1 主要试剂的配制15-20
• 2.2 菌株、载体和细胞株20-21
• 2.3 仪器设备21
• 2.4 主要试剂21-23
• 3 实验方法23-31
• 3.1 载体的构建23-24
• 3.2 载体的鉴定24
• 3.3 质粒的提取24-25
• 3.4 稳定株的构建25-26
• 3.5 细胞的收集、裂解和蛋白的提取26
• 3.6 BCA 试剂盒测定细胞总蛋白浓度26-27
• 3.7 Western blotting 检测蛋白表达水平27-29
• 3.8 Luciferase assay 荧光素酶试验29-31
• 4 结果31-37
• 4.1 载体质粒的扩增31
• 4.2 载体质粒的酶切鉴定31-32
• 4.3 载体质粒的测序鉴定32
• 4.4 稳定株的构建32-33
• 4.5 Western blotting 验证下游蛋白表达33
• 4.6 Western blotting 结果灰度分析33-34
• 4.7 Luciferase assay 结果34-37
• 5 讨论37-41
• 结论41-43
• 参考文献43-45
• 文献综述45-58
• 参考文献55-58
• 致谢58-60
• 在读期间发表的学位论文目录60-61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 马增翼;张军;李雪丽;席子明;胡延忠;;热休克转录因子4b的克隆表达及MAP激酶P38对其磷酸化调控[J];细胞与分子免疫学杂志;2010年04期

本文编号：1123517